香石竹ACC氧化酶基因RNAi載體構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、乙烯是植物五大類內(nèi)源激素之一，是促進植物衰老的主要物質(zhì)，因此在植物抗衰老研究，特別是在延長鮮切花采后貯藏期和貨架期方面日益成為研究熱點。傳統(tǒng)的保鮮方法多采用乙烯抑制劑或乙烯拮抗劑等化學(xué)物質(zhì)，不僅造成環(huán)境污染，且成本較高，采用生物技術(shù)改良鮮切花的乙烯代謝特性為這一問題的解決帶來了希望。本研究在克隆香石竹(Dianthus caryophyllus L.)乙烯合成關(guān)鍵酶ACC氧化酶(ACO)基因片段的基礎(chǔ)上，依據(jù)RNA干擾(RNAi)原理，

2、構(gòu)建了香石竹ACO基因的RNAi植物表達載體，并利用二次回歸正交設(shè)計方法對香石竹再生體系進行了優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體導(dǎo)入了香石竹不同品種。主要結(jié)果如下： 1.香石竹ACO基因片段的克隆及其RNAi表達載體的構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的香石竹ACO基因序列，設(shè)計一對特異引物，利用PCR技術(shù)從香石竹‘Master’、‘Tasman’和‘Isabelle’3個品種基因組中均擴增得到ACO基因的1個片段。從‘Ma

3、ster’克隆得到的片段(831bp)，與已發(fā)表的香石竹ACO基因相應(yīng)序列同源性為98.9％，再以此片段為模版克隆擴增得到其相應(yīng)小片段(536bp)，將上述2個片段反向連接，插入到植物表達載體pCAMBIA1301中，構(gòu)建成香石竹ACO基因的RNAi載體。經(jīng)檢驗，插入片段轉(zhuǎn)錄后可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，確認載體構(gòu)建成功。 2.香石竹再生體系的優(yōu)化 以‘Tasman’葉片為外植體，利用二次回歸正交設(shè)計對其再生體系建立中的關(guān)鍵因素6-

4、BA和NAA的濃度及其組合進行定量優(yōu)化。結(jié)果表明，增殖培養(yǎng)基中6-BA 1.21mg/L、NAA 0.35 mg/L時，不定芽增殖數(shù)量可達3.65；6-BA 1.20～1.79 mg/L，NAA 0.15～0.63mg/L時，不定芽增殖系數(shù)大于2，可靠性為95％。在置信范圍內(nèi)選取6-BA 1.2 mg/L和NAA 0.3 mg/L的濃度組合分別進行 ‘Tasman’、‘Maser’和‘Isabelle’無菌苗驗證實驗，得到平均增殖系數(shù)為

5、3.57、3.75和3.26。確立分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA0.3mg/L。 3.香石竹ACO基因RNAi表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化 利用電擊法將ACO基因的RNAi載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101菌株，對香石竹的‘Master’、‘Tasman’和‘Isabelle’3個品種進行了遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，香石竹對潮霉素比較敏感，確定葉片分化選擇壓力為4～5 mg/L；轉(zhuǎn)化程序為：‘Master’、‘Tasman

6、’和‘Isabelle’無菌苗在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后，將葉片帶基部撕下，接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d后，于制備好的農(nóng)桿菌菌液中(OD<,600>為0.6～0.8)浸泡8～12min，接種于含 100μmol·L<'-1>乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.3 mg/L上培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3w繼代一次?？剐匝块L至1cm左右時切下，轉(zhuǎn)至MS培養(yǎng)基中生根，增殖，