ACC氧化酶基因反義表達載體的構建及其對白姜花愈傷組織的轉化.pdf

1、花卉產業(yè)已成為世界上最具活力的產業(yè)之一。人們通過常規(guī)雜交育種、輻射育種、組織培養(yǎng)育種、多倍體育種、航天育種等手段培育了大量的花卉新品種。尤其是二十世紀九十年代以來，隨著分子生物學和基因工程技術的發(fā)展，利用轉基因技術培育新品種成為育種工作者研究的熱點。將目的基因定向導入植物細胞或組織中，培育成植株，則可獲得人們預期的新品種，從而為花卉的定向育種提供了一條更有效的新途徑。 白姜花(Hedychium coronarium)為姜科姜花

2、屬一種多年生草本植物。其花色潔白、花型美麗、花香宜人，極具觀賞價值，深受消費者青睞，在我國南方廣泛栽培并主要用作香型切花、庭院綠化和園林景觀植物。然而，白姜花切花的瓶插壽命較之其他切花短，一般只有2-3天。研究已表明，乙烯在白姜花衰老過程中可能起著重要作用。因此控制切花開放過程中乙烯的產量是延遲衰老的有效途徑之一。通過農桿菌介導的遺傳轉化方法導入乙烯合成相關反義基因或利用RNAi技術，抑制白姜花切花的乙烯合成，將是獲得花期延長的白姜花新

3、品種的非常值得探索的育種途徑。 本論文旨在已建立白姜花再生體系的基礎上，利用苜蓿ACC氧化酶基因片段，構建ACC氧化酶基因反義表達載體，優(yōu)化影響該基因農桿菌介導的遺傳轉化體系的主要因素，以期將反義ACO基因導入到白姜花中，獲得花期延長的白姜花花新材料。主要研究結果如下： 1.優(yōu)化了白姜花花絲愈傷組織繼代培養(yǎng)基，研究了2,4-D對白姜花花絲愈傷組織生長的影響。結果發(fā)現(xiàn)，2，4-D濃度為2.0mg/L的花絲繼代培養(yǎng)基中，愈

4、傷組織增殖速度最快，同時，在一定程度上也減少了愈傷組織的褐變，利于繼代培養(yǎng)。合適的白姜花花絲愈傷組織繼代培養(yǎng)基成分為：MS+6-BA(1.0 mg/L)+2,4-D(2.0 mg/L)+NAA(4.0 mg/L)。 2.從實驗室保存得苜蓿葉片ACC氧化酶基因片段中亞克隆了814bp的片段，構建了ACC氧化酶基因片段反義表達載體：將苜蓿ACC氧化酶基因該片段反向插入帶有XbaI和BamHI兩個酶切位點的pMD20-T Vector

5、(TaKaRa)上，得到ACO-T質粒；用Xba Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切ACO-T質粒和pBI121質粒；電泳后分別回收800bp小片段和14kb大片段，二者連接克隆到E.coli DH5α中擴繁：提取質粒對表達載體進行酶切驗證并測序，證實反義ACO基因已插入pBⅠ121多克隆位點。將此質粒稱為pBⅠ121-Alf-ACO。該質粒載體含在35S啟動子調控下的ACO基因、GUS基因和nptⅡ基因。然后通過凍融法將其轉入農桿菌EHA105。

6、 3.建立了白姜花花絲愈傷組織為受體的轉化體系：首先研究了花絲愈傷組織的cef脫農桿菌的濃度、卡那霉素(KM)篩選濃度以及影響轉化頻率的因素。確定白姜花愈傷組織的根癌農桿菌介導的轉化體系：愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0 mg/L)+2，4-D(2.0 mg/L)+NAA(4.0 mg/L)。根癌農桿菌離心后懸浮于愈傷組織繼代液體培養(yǎng)基中作為農桿菌工程菌液?；ńz愈傷組織在OD<,600>=0.2的根癌農桿菌菌液中浸染3

7、0min后，在花絲愈傷組織分化培養(yǎng)基(DM-F：MS+0.1 mg/LTDZ+0.2 mg/L NAA)上共培養(yǎng)3-4d；以500mg/L Cef為脫菌濃度，含75ml/L KM的DM.F培養(yǎng)基上進行愈傷組織抗性篩選。 4. GUS基因表達的組織化學染色表明，擬轉化愈傷組織出現(xiàn)藍色反應，說明GUS基因在該組織中得以表達。由于在pBl121-Alf-ACO載體上ACC氧化酶反義基因和GUS基因是順序串聯(lián)排列，因此初步判定ACC氧化