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鴨梨多酚氧化酶基因克隆及其反義轉(zhuǎn)化的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、在梨果實(shí)生產(chǎn)和加工過(guò)程中,多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)的大量存在引發(fā)了果實(shí)的迅速褐變,給果品的外觀品質(zhì)和加工性能帶來(lái)了嚴(yán)重的影響,已經(jīng)成為困擾我國(guó)梨果品生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)的主要難題之一,生產(chǎn)上急需對(duì)其進(jìn)行性狀改良。本研究以降低原產(chǎn)我國(guó)梨品種——鴨梨果實(shí)組織內(nèi)多酚氧化酶含量為目標(biāo),圍繞著多酚氧化酶基因開(kāi)展了基因克隆、序列分析、反義表達(dá)載體構(gòu)建以及遺傳轉(zhuǎn)化等一系列研究,最終獲得了低多酚氧化酶活性的轉(zhuǎn)基因鴨梨植株,從而為

2、從根本上解決梨果實(shí)褐變問(wèn)題、培育抗褐變梨新品種奠定了基礎(chǔ)。所取得的主要成果如下所示:
   1.根據(jù)多酚氧化酶基因保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以鴨梨果實(shí)cDNA為模板擴(kuò)增得到1782bp的鴨梨多酚氧化酶基因cDNA片段,并以此序列為基礎(chǔ)RACE擴(kuò)增該基因cDNA全長(zhǎng),得到了長(zhǎng)度的2126bp的鴨梨多酚氧化酶基因cDNA全長(zhǎng)序列,進(jìn)一步根據(jù)得到的cDNA序列開(kāi)放性讀碼框設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到鴨梨多酚氧化酶基因DNA序列,結(jié)果顯示該基因cDNA

3、序列和DNA序列堿基組成無(wú)差異,證實(shí)鴨梨多酚氧化酶基因組成上不具備內(nèi)含子。
   2.對(duì)鴨梨多酚氧化酶基因所翻譯氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明該氨基酸序列與其它物種多酚氧化酶高度同源,且包含一個(gè)由210個(gè)氨基酸殘基組成的酪氨酸酶超級(jí)家族保守結(jié)構(gòu)域,具有一個(gè)酪氨酸酶CuA結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)酪氨酸CuB結(jié)合位點(diǎn),證實(shí)鴨梨多酚氧化酶屬酪氨酸酶超級(jí)家族成員,該酶在發(fā)揮酶促作用時(shí)需要Cu2+作為輔因子。
   3.基于所獲得的

4、氨基酸序列對(duì)鴨梨多酚氧化酶進(jìn)行蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示鴨梨多酚氧化酶應(yīng)屬于全α-結(jié)構(gòu)的珠蛋白型α-螺旋蛋白;該蛋白的疏水性氨基酸位于分子內(nèi)部,親水性氨基酸位于分子表面,具有可溶性親水蛋白的典型特征,不具備跨膜結(jié)構(gòu),故推測(cè)鴨梨多酚氧化酶在細(xì)胞中的定位應(yīng)該位于類(lèi)囊體腔中。
   4.首次構(gòu)建了鴨梨葉片再生體系,確定鴨梨最佳葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+BA3.0mg/L+IAA0.5mg/L,再生頻率和再生芽數(shù)分別為80%和1

5、.77;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L,增殖系數(shù)可達(dá)2.23;最佳繼代培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L,平均苗高4.98cm;最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L,生根率和平均根數(shù)分別為50%和2.04。
   5.首次構(gòu)建了鴨梨多酚氧化酶基因的反義表達(dá)載體。根據(jù)所克隆到的鴨梨多酚氧化酶基因序列,選擇3’端450bp序列片段,與切除Gus基因的

6、真核表達(dá)載體pBI121反向連接后,電轉(zhuǎn)儀法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,經(jīng)酶切和PCR鑒定證實(shí),鴨梨多酚氧化酶基因反義表達(dá)載體構(gòu)建成功,并已整合到農(nóng)桿菌上。
   6.首次優(yōu)化建立了鴨梨的遺傳轉(zhuǎn)化體系。在鴨梨葉片再生體系的基礎(chǔ)上對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的各方面因素進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示,當(dāng)葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)2天,農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.4、侵染5min、共培養(yǎng)2天時(shí)出愈率和轉(zhuǎn)化率最高,而愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加400μg/ml的羧芐青霉素

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