RNA干擾誘導(dǎo)馬鈴薯多酚氧化酶基因沉默的初步研究.pdf

1、馬鈴薯薯塊受到損傷使自身所含的多酚氧化酶與酚類物質(zhì)的空間隔離被打破，多酚氧化酶在空氣中氧分子的作用下催化酚類物質(zhì)為苯醌類物質(zhì)，苯醌類物質(zhì)穩(wěn)定性較差，容易在不依賴酶的作用下，自身聚合后與體內(nèi)的親和性氨基酸等發(fā)生作用生成褐色、黑色物質(zhì)，嚴(yán)重影響了馬鈴薯在加工過程中的品質(zhì)。 目前，應(yīng)用于植物中基因沉默的最新策略是體外將目的基因反向重復(fù)連接到內(nèi)含子兩端，轉(zhuǎn)入植物基因組中，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生自我互補(bǔ)的雙鏈RNA，誘導(dǎo)同源基因的轉(zhuǎn)錄后沉默。這種RN

2、A干擾技術(shù)具有沉默效率高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們克隆了馬鈴薯的多酚氧化酶基因POT33，并將其高度保守的部分序列反向重復(fù)連接到載體pKANNABAL上，獲得了中間載體pKANNABAL-ihpPOT33；然后將反向重復(fù)的序列連同它們之間的內(nèi)含子序列一同連入植物雙元載體pMBW330和pGB121s上，構(gòu)建了分別由35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的組成型沉默載體pMBW330-ihpPOT33和由GBSS啟動(dòng)子啟動(dòng)的薯塊特異性沉默載體pGB12

3、1s-ihpPOT33，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化加工型馬鈴薯大西洋。通過胚性愈傷組織誘導(dǎo)再生途徑獲得75株再生植株。對(duì)轉(zhuǎn)化后的馬鈴薯進(jìn)行PCR、Western分子生物學(xué)檢測(cè)。結(jié)果顯示，2株再生植株的葉片中分子量略小于66 kD的多酚氧化酶的表達(dá)被抑制。利用軟件Bandscan5.0分析Western檢測(cè)結(jié)果，數(shù)據(jù)顯示2株低表達(dá)多酚氧化酶的再生植株的沉默效率分別為86.02％和66.10％。關(guān)于在薯塊中檢測(cè)多酚氧化酶基因的表達(dá)以