RNA干擾靶向環(huán)氧化酶-2治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、環(huán)氧化酶(Cyclooxygenases,COXs)是花生四烯酸(arachidonicacid，AA)合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶。已知COXs至少有兩種亞型，即COX一1和COX-2。COX-1屬結(jié)構(gòu)型酶，在多種組織中均有表達(dá)，其催化產(chǎn)物參與維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性；COX-2屬誘導(dǎo)型酶，在正常組織中基本無(wú)表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激因素包括細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、促癌劑等作用時(shí)，COX-2表達(dá)迅速上調(diào)。研究表明

2、，COX-2不僅是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，而且還可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡，促進(jìn)腫瘤新生血管形成等機(jī)制參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。 RNA干擾(RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilence，PTGS)的基因阻斷技術(shù)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞抑制基因表達(dá)。在本課題中，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)COX-2的siRNA，轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，并進(jìn)行裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)COX

3、-2mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化；觀察siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；探討RNAi轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后相關(guān)信號(hào)分子的變化等，為胃癌的基因治療探索新的方法。 第一部分 目的：構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，觀察其在胃癌細(xì)胞中抑制外源GFP的表達(dá)作用，為下一步設(shè)計(jì)COX-2基因的siRNA提供技術(shù)支持。 方法：設(shè)計(jì)、合成含GFP編碼基因片段的siRNA，與轉(zhuǎn)錄載體pTZU6+I連接，構(gòu)建psh

4、RNA—GFP重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒pshRNA—GFP與pEGFP-C1共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC-823和SGC-7901，檢測(cè)pshRNA—GFP對(duì)GFP表達(dá)的影響。 結(jié)果：成功構(gòu)建針對(duì)GFP的siRNA重組載體pshRNA-GFP，并經(jīng)序列分析驗(yàn)證；應(yīng)用熒光顯微鏡證實(shí)重組載體pshRNA-GFP對(duì)共轉(zhuǎn)染的pEGFP-C1中綠色熒光蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用，明顯高于對(duì)照組，抑制率大于70％；Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明應(yīng)用

5、pshRNA-GFP作用后GFP蛋白表達(dá)明顯減少。 結(jié)論：構(gòu)建的pshRNA-GFP重組質(zhì)粒能有效地抑制GFP基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。 第二部分 目的：構(gòu)建環(huán)氧化酶一2(COX-2)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，檢測(cè)其在胃癌細(xì)胞株SGC-790l中對(duì)COX-2基因表達(dá)的抑制作用。 方法：根據(jù)COX-2編碼基因，設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)反向重復(fù)序列，分別定向克隆至載體pTZU6+1的U6轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下，構(gòu)建pshRN

6、A-COX-2質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變質(zhì)粒pshRNA-COX-2’，分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC一790l，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)pshRNA-COX-2和pshRNA-COX-2，對(duì)COX-2基因表達(dá)的抑制作用。 結(jié)果：酶切電泳分析和DNA測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pshRNA-COX-2和pshRNA-COX-2’構(gòu)建成功；pshRNA-COX-2對(duì)內(nèi)源COX-2基因的表達(dá)有明顯的抑制作用，明顯高于對(duì)照組，抑制率達(dá)70-80

7、％：pshRNA一一COX-2'對(duì)目的基因基本無(wú)抑制作用。 結(jié)論：構(gòu)建的重組質(zhì)粒pshRNA-COX-2能特異而有效抑制內(nèi)源性COX-2基因在SGC-790l細(xì)胞中的表達(dá)，為下一步研究siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響打下基礎(chǔ)。 第三部分 目的：研究COX-2特異的siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-790l增殖和凋亡的影響以及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的改變。 方法：pshRNA-COX-2和pshRNA-COX-2’分別

8、轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，MTT法觀察細(xì)胞增殖，TUNEL、電鏡觀察細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期，Westernblot檢測(cè)信號(hào)分子表達(dá)。 結(jié)果：pshRNA-COX-2轉(zhuǎn)染后，SGC-7901細(xì)胞增殖明顯被抑制；TUNEL可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞；細(xì)胞周期中S期細(xì)胞減少，而G0/Gl期細(xì)胞增加；PCNA、Ki67、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)下降，p53和Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)。pshRNA-COX

9、-2’轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞未見(jiàn)明顯改變。 結(jié)論：pshRNA-COX-2對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-790l的增殖有明顯抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是siRNA作用機(jī)制之一。 第四部分 目的：利用RNAi技術(shù)在胃癌SGC-7901細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤內(nèi)抑制COX-2表達(dá)，探討可能的作用機(jī)制。 方法：將胃癌細(xì)胞株SGC-7901注射入裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。pshRNA-COX-2導(dǎo)入胃癌組織中，在體內(nèi)誘導(dǎo)R

10、NAi，觀察腫瘤體積的變化，采用RT-PCR和Westernblot檢測(cè)COX-2基因表達(dá)的變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMP-2，MMP-9和VEGF表達(dá)變化。 結(jié)果：pshRNA-COX-2導(dǎo)入裸鼠皮下移植瘤后15d，與對(duì)照相比，腫瘤體積明顯縮小，COX-2的mRNA下調(diào)78．32％，COX-2蛋白下調(diào)70．44％；同時(shí)，MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。 結(jié)論：RNA干擾明顯抑制了靶基因COX-2的表達(dá)