RNA干擾靶向熱休克蛋白70治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物在不利條件下產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)體的蛋白，具有重要的病理、生理功能。在正常時(shí)以較低水平表達(dá)；在環(huán)境溫度變化、炎癥、發(fā)熱、微生物感染、腫瘤、放射等情況下均誘導(dǎo)其合成，從而減輕不利條件下導(dǎo)致的損害。近年研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中充當(dāng)了多重角色，一方面作為“分子伴侶”參與腫瘤細(xì)胞的功能代謝，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受有害因素的損害；另一方面作為腫瘤細(xì)胞與機(jī)體正常細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、

2、分化的異質(zhì)性，使HSP70成為與其相結(jié)合的腫瘤抗原多肽的靶載體，在參與腫瘤抗原的免疫反應(yīng)中充當(dāng)了免疫佐劑的作用。 RNA干擾(RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptionalgene silence，PTGS)的基因阻斷技術(shù)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞抑制基因表達(dá)。通過(guò)RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer的作用產(chǎn)生有活性的小的21-23nt干擾性RNA(short interence RNA，siRNA)，介

3、導(dǎo)其互補(bǔ)同源mRNA序列的特異性降解，沉寂目的基因的表達(dá)。 本課題采用RNAi技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)HSP70基因的siRNA，轉(zhuǎn)染胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，并進(jìn)行裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)HSP70mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的變化；觀察siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；為胃癌的基因治療探索新的方法。 第一部分 目的：構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，觀察其在胃癌細(xì)胞中抑制外源GFP的表達(dá)作

4、用，為下一步設(shè)計(jì)Hsp70基因的siRNA提供技術(shù)支持。 方法：設(shè)計(jì)、合成含GFP編碼基因片段的siRNA，與轉(zhuǎn)錄載體pTZU6+1連接，構(gòu)建pshRNA-GFP重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒pshRNA-GFP與pEGFP-C1共轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株BGC-823和SGC-7901，檢測(cè)pshRNA-GFP對(duì)GFP表達(dá)的影響。 結(jié)果：成功構(gòu)建針對(duì)GFP的siRNA重組載體pshRNA-GFP，并經(jīng)序列分析驗(yàn)證；應(yīng)用熒光顯微鏡證實(shí)重組載體

5、pshRNA-GFP對(duì)共轉(zhuǎn)染的pEGFP-C1中綠色熒光蛋白的表達(dá)有明顯的抑制作用，明顯高于對(duì)照組，抑制率大于70％；Westeril blot檢測(cè)結(jié)果表明應(yīng)用pshRNA-GFP作用后GFP蛋白表達(dá)明顯減少。 結(jié)論：構(gòu)建的pshRNA-GFP重組質(zhì)粒能有效地抑制GFP基因在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。 第二部分 目的：構(gòu)建Hsp70的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)，檢測(cè)其在胃癌細(xì)胞株SGC-7901中對(duì)Hsp70基因表達(dá)的

6、抑制作用。 方法：根據(jù)Hsp70編碼基因，設(shè)計(jì)并合成3對(duì)反向重復(fù)序列，分別定向克隆至載體pTZU6+1的U6轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下，構(gòu)建pshRNA-Hsp70質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變質(zhì)粒pshRNA-Hsp70’，分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC-7901，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)pshRNA-Hsp70和pshRNA-HspT0’對(duì)Hsp70基因表達(dá)的抑制作用。 結(jié)果：酶切電泳分析和DNA測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pshRNA-

7、Hsp70和pshRNA-Hsp70’構(gòu)建成功；pshRNA-Hsp70對(duì)內(nèi)源Hsp70基因的表達(dá)有明顯的抑制作用，明顯高于對(duì)照組；pshRNA-Hsp70’對(duì)目的基因基本無(wú)抑制作用。 結(jié)論：構(gòu)建的重組質(zhì)粒pshRNA-Hsp70能特異而有效抑制內(nèi)源性Hsp70基因在SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)，為下一步研究siRNA對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響打下基礎(chǔ)。 第三部分 目的：利用RNAi技術(shù)在胃癌SGC-7901細(xì)胞裸鼠皮

8、下移植瘤內(nèi)抑制Hsp70表達(dá)，探討pshRNA-Hsp70在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。 方法：將胃癌細(xì)胞株SGC-7901 注射入裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。pshRNA-Hsp70導(dǎo)入胃癌組織中，在體內(nèi)誘導(dǎo)RNAi，采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)Hsp70基因表達(dá)的變化．并觀察腫瘤體積的變化。 結(jié)果：pshRNA-Hsp70導(dǎo)入裸鼠皮下移植瘤后15d，與對(duì)照相比，Hsp70的mRNA和Hsp70蛋白顯