RNA干擾技術(shù)靶向阻抑HPV表達及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒的細胞株腫瘤特性的實驗研究.pdf_第1頁
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1、中南大學博士學位論文RNA干擾技術(shù)靶向阻抑HPV表達及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒的細胞株腫瘤特性的實驗研究姓名：張克強申請學位級別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科學指導教師：林秋華20040301中南大學博士學位論文高效表達HPVE6、E7siRNA的DNA載體。目的：設(shè)計并構(gòu)建針對HPVl8E6、E7基因mRNA的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，研究此細胞株中HPV的RNA干擾抑制效率，以及對細胞株腫瘤特性的的影響，初步探討RNA干擾技

2、術(shù)防治HPV感染的宮頸癌的可行性。方法：采用克隆有人III型RNA聚合酶Hl啟動子的pSUPER質(zhì)粒，設(shè)計并構(gòu)建針對HPVl8E6、E7基因mRNA的、可穩(wěn)定遺傳的編碼發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體。同時利用pcDNA31質(zhì)粒的新霉素抗性，在陽離子脂質(zhì)體介導下，共轉(zhuǎn)染HPVl8陽性的人宮頸癌Hela細胞株，通過G418篩選出陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆，采用免疫組化及半定量RTPCR分別檢測其HPV蛋白表達水平及mRNA的改變。流式細胞儀

3、分析、軟瓊脂培養(yǎng)檢測其對宮頸癌細胞腫瘤特性的改變，來研究RNA干擾載體的有效性。結(jié)果：限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和DNA測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的RNA干擾載體pE61hpRNA、pE72hpRNA符合實驗設(shè)計要求。細胞水平共轉(zhuǎn)染及G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pE61hpRNA質(zhì)粒的hela細胞株，其對HPVl8E6產(chǎn)生的RNA干擾抑制效應達到333％。流式細胞儀分析、軟瓊脂培養(yǎng)檢測顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pE61hpRNA質(zhì)粒的細胞株與未轉(zhuǎn)染的細胞株相比，其

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