RNA干擾技術(shù)靶向阻抑HPV表達(dá)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒的細(xì)胞株腫瘤特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中南大學(xué)博士學(xué)位論文RNA干擾技術(shù)靶向阻抑HPV表達(dá)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNA干擾質(zhì)粒的細(xì)胞株腫瘤特性的實(shí)驗(yàn)研究姓名：張克強(qiáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：林秋華20040301中南大學(xué)博士學(xué)位論文高效表達(dá)HPVE6、E7siRNA的DNA載體。目的：設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)HPVl8E6、E7基因mRNA的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，研究此細(xì)胞株中HPV的RNA干擾抑制效率，以及對(duì)細(xì)胞株腫瘤特性的的影響，初步探討RNA干擾技

2、術(shù)防治HPV感染的宮頸癌的可行性。方法：采用克隆有人III型RNA聚合酶Hl啟動(dòng)子的pSUPER質(zhì)粒，設(shè)計(jì)并構(gòu)建針對(duì)HPVl8E6、E7基因mRNA的、可穩(wěn)定遺傳的編碼發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的特異性RNA干擾質(zhì)粒載體。同時(shí)利用pcDNA31質(zhì)粒的新霉素抗性，在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下，共轉(zhuǎn)染HPVl8陽性的人宮頸癌Hela細(xì)胞株，通過G418篩選出陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，采用免疫組化及半定量RTPCR分別檢測(cè)其HPV蛋白表達(dá)水平及mRNA的改變。流式細(xì)胞儀

3、分析、軟瓊脂培養(yǎng)檢測(cè)其對(duì)宮頸癌細(xì)胞腫瘤特性的改變，來研究RNA干擾載體的有效性。結(jié)果：限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和DNA測(cè)序結(jié)果顯示，構(gòu)建的RNA干擾載體pE61hpRNA、pE72hpRNA符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。細(xì)胞水平共轉(zhuǎn)染及G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pE61hpRNA質(zhì)粒的hela細(xì)胞株，其對(duì)HPVl8E6產(chǎn)生的RNA干擾抑制效應(yīng)達(dá)到333％。流式細(xì)胞儀分析、軟瓊脂培養(yǎng)檢測(cè)顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pE61hpRNA質(zhì)粒的細(xì)胞株與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株相比，其