小RNA干擾對高表達(dá)RegIα基因胃癌細(xì)胞株增殖的影響.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一,其年齡標(biāo)化發(fā)病率和死亡率均居我國常見惡性腫瘤之首。由于絕大多數(shù)胃癌患者缺乏特異性臨床癥狀,胃癌的總體五年生存率約30％。胃癌化療產(chǎn)生的抗藥性和藥物毒性反應(yīng)是中晚期患者治療失敗的主要原因。RegIα(regenerative geneIα)屬再生基因家族,在人體中主要分布于胰腺和胃粘膜中,由166個氨基酸組成的含信號肽的蛋白質(zhì)。研究顯示RegIα蛋白對胃黏膜細(xì)胞具有促進(jìn)增殖和抗凋亡作用,在胃癌細(xì)胞中呈過度表達(dá)

2、,并與胃癌的T分期,分化程度,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的總體生存率有關(guān)。因此認(rèn)為,RegIαα基因表達(dá)異常與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是潛在的生物治療靶向基因。2002年小RNA干擾技術(shù)被視為重大科學(xué)突破,它能在轉(zhuǎn)錄后水平特異性沉默某個基因表達(dá)。此技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各類癌癥研究中,但對胃癌RegIα基因的作用及其機(jī)制的報(bào)道很少。本研究以RegIα基因?yàn)榘袠?biāo),構(gòu)建小RNA干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染RegIα基因高表達(dá)胃癌細(xì)胞,通過細(xì)胞和分子生物實(shí)驗(yàn)觀察其對胃癌細(xì)

3、胞株RegIα干擾作用及細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探討利用小RNA干擾技術(shù)進(jìn)行胃癌基因治療的可能性。
　　 首先采用RT-PCR法檢測6株胃癌細(xì)胞RegIα基因mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示:MKN45和AGS胃癌細(xì)胞株高表達(dá)RegIαmRNA。隨后根據(jù)RNAi設(shè)計(jì)原則,尋找靶序列兩條,合成shRNA的DNA模板單鏈,包括siRNA的正義鏈和反義鏈。模板鏈兩端設(shè)計(jì)BamHI,ALF-Ⅱ酶切位點(diǎn),載體標(biāo)記基因GFP(綠色熒光蛋白),陰性對

4、照為空載體。
　　 于體外構(gòu)建RegIα基因小RNA干擾的重組質(zhì)粒后,將帶有RegIαRNAi表達(dá)載體和空載體的DH5α大腸桿菌在LP Amp培養(yǎng)基上涂板,37℃培養(yǎng)過夜,挑取單克隆菌落,37℃搖菌過夜,18小時(shí)后抽提純化質(zhì)粒。紫外分光光度儀檢測OD值,λ-HindⅢ觀察質(zhì)粒純度。重組質(zhì)粒雙酶切進(jìn)行瓊脂糖電泳驗(yàn)證,并送南京金思特公司檢測核苷酸序列。
　　 獲得RegIαRNAi質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒后,對RegIα高表達(dá)細(xì)胞株

5、MKN45和AGS進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天,將對數(shù)生長期的人胃癌MKN45和AGS細(xì)胞以每孔1×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。待第二天細(xì)胞增至80％左右,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至兩株細(xì)胞中。24小時(shí)后熒光顯微鏡判斷轉(zhuǎn)染效率。
　　 轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,細(xì)胞1:100倍數(shù)稀釋傳代到96孔板中,一天后換成600μg/ml(MKN45)和400μg/ml(AGS)G418進(jìn)行篩選,每2-3天換培液與G418。3周后,挑取單克隆生長細(xì)胞株,繼續(xù)篩選

6、1周,改維持濃度,持續(xù)壓力篩選。熒光顯微鏡判斷篩選效果。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證RegIαRNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的建立,應(yīng)用RT-PCR和Western blot測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RegIα基因及其蛋白的表達(dá)水平。RT-PCR結(jié)果顯示:與空載體組相比,轉(zhuǎn)染RegIα小RNA干擾質(zhì)粒后,MKN45和AGS細(xì)胞的RegIαmRNA明顯被抑制;Western blot結(jié)果顯示:MKN45,AGS細(xì)胞的RegIα蛋白表達(dá)水平分別降低,是空載體組的(

7、44±4)％和(25±4)％。
　　 為了觀察RegIαRNAi對胃癌細(xì)胞生長周期的影響,我們應(yīng)用了MTT法連續(xù)觀察4天,結(jié)果發(fā)現(xiàn):RegIα小RNA干擾后MKN45與AGS細(xì)胞增殖均受到抑制,細(xì)胞從第二天開始生長變慢,形態(tài)多數(shù)呈桿狀或梭形,部分呈三角形或不規(guī)則形,細(xì)胞空泡現(xiàn)象較空載體組常見,說明RegIα小RNA干擾可以抑制細(xì)胞生長。我們進(jìn)一步用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法流式細(xì)胞儀分析RegIαRNAi對胃癌細(xì)

8、胞的凋亡作用,結(jié)果顯示:RegIαRNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MKN45和AGS細(xì)胞后,凋亡率分別為(12.96±0.5)％和(11.59±1.1)％,較空載體組凋亡率(3.99±0.3)％和(4.22±0.4)％明顯增高(P＜0.05),說明RegIα小RNA干擾可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 (1)MKN45和AGS胃癌細(xì)胞株高表達(dá)RegIαmRNA。
　　 (2)MKN45和AGS轉(zhuǎn)染RegIαRNAi后,Re