沉默F(xiàn)AK基因表達(dá)對人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3增殖、遷移、凋亡的影響.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文沉默F(xiàn)AK基因表達(dá)對人肝癌細(xì)胞株HCCLM3增殖、遷移、凋亡的影響姓名：阿力亞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：何強(qiáng)20100526中山人學(xué)碩士學(xué)位論文沉默F(xiàn)AK基岡表達(dá)對人肝癌細(xì)胞株HOCLM3增殖、遷移、凋亡的影響方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的FAK基因序列(GI：439874)構(gòu)建FAK基因shRNA的重組質(zhì)粒FAKpSupershRNA。經(jīng)測序鑒定后，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染入包裝病毒細(xì)胞PHOENI

2、X，優(yōu)化篩選條件，以lug／ml嘌呤霉素篩選3~4周獲得陽性克隆，以病毒包裝細(xì)胞上清濾液感染LM3細(xì)胞株，Iug／ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，40d左右獲得不同抑制率的陽性克隆，選取抑制率最高穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株命名為LM3pSuperFAK。通過Westemblot檢測抑制效率并應(yīng)用劃痕實驗、流式細(xì)胞術(shù)、MTT實驗比較LM3pSuperFAK組與對照組遷移、凋亡及增殖的區(qū)別。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒FAKpSupershRNA并經(jīng)

3、測序鑒定基因序列正確。(2)篩選最佳濃度，實驗顯示lug／ml嘌呤霉素篩選時為細(xì)胞最小致死濃度。(3)Westernblot：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒FAKpSupershRNA后能使肝癌細(xì)胞LM3的FAK蛋白的表達(dá)下調(diào)。根據(jù)篩選的不同陽性克隆可有不同的抑制率。其中抑制率最高的克隆下調(diào)FAK表達(dá)為5965％。(4)細(xì)胞劃痕試驗顯示下調(diào)FAK明顯抑制細(xì)胞遷移能力。(5)流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期及凋亡：下調(diào)FAK表達(dá)后LM3細(xì)胞細(xì)胞增殖指數(shù)為369％，對

4、照組為611％，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(po05)；且細(xì)胞多被阻滯在G0／Gl期，S期明顯減少。下調(diào)FAK表達(dá)后細(xì)胞凋亡百分比為600％，而對照組為O88％，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p005)。(6)MTT：下調(diào)FAK表達(dá)后細(xì)胞增殖抑制率為2797％，對照組為545％，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(po05)。結(jié)論：重組質(zhì)粒FAKpSupershRNA被構(gòu)建并成功篩選出高抑制率的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，降低細(xì)胞增殖、遷移能力，為后續(xù)研究以及肝癌的基因治療奠定了基礎(chǔ)。關(guān)