RNAi沉默F(xiàn)AK表達對Hep-2細胞株增殖及侵襲能力影響的實驗研究.pdf

1、頭頸部鱗形細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)是人類常見的惡性腫瘤之一，其中喉癌占7.9％-35％。過去幾十年里，盡管診療技術不斷提高，喉癌的生存率仍然沒有明顯提高，這與腫瘤細胞的遠處轉移密切相關。區(qū)域淋巴結轉移是致死性進程的主要原因之一，也是腫瘤預后主要指標和指導治療的重要依據(jù)。許多學者致力于研究腫瘤侵襲、轉移的分子學依據(jù)，期待能發(fā)現(xiàn)更精確更可靠的生物學標志。癌細胞對細胞外基

2、質的黏附性降低是腫瘤細胞遷移、侵襲、轉移的重要原因之一。粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一個多功能的非受體酪氨酸激酶，它在細胞間及細胞與細胞外基質粘附中起關鍵作用。有學者研究證明，F(xiàn)AK與乳腺癌、直腸癌、甲狀腺癌、肝癌、前列腺癌的侵襲及轉移密切相關，而在頭頸部腫瘤的研究甚少。本課題以頭頸部常見惡性腫瘤喉癌為研究對象，利用免疫組化研究喉癌組織及細胞株中FAK的表達，再進一步研究利用RAN干擾(RNA in

3、terference)沉默F(xiàn)AK表達對喉癌Hep-2細胞株生物學行為的影響。實驗共分兩部分： 第一部分、FAK在喉癌組織及細胞株中的表達。 目的：本部分以喉癌組織及Hep-2細胞株為研究對象，采用免疫組化SP法及細胞免疫方法分別檢測FAK在喉癌組織及細胞株中的表達，并研究其表達與患者臨床病理特征之間的關系。 方法： (1)隨機抽取42例喉癌患者組織病理標本，以同期聲帶息肉組織標本作為對照。采用免疫組織化學

4、法檢測喉癌組織中FAK的表達，并結合患者的臨床病理資料對結果進行統(tǒng)計分析。 (2)常規(guī)培養(yǎng)喉癌Hep-2細胞株，采用免疫細胞化學法檢測Hep-2細胞株中的FAK表達。 結果： (1)喉癌組織中FAK的表達：喉癌組織中FAK的陽性表達率78.57％(33/42)，對照組(聲帶息肉)中陽性率12.50％(5/40)(P＜0.05)；喉癌組織中FAK的表達與臨床分期、頸部淋巴結轉移比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，

5、與病理學分級及臨床分型比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (2)喉癌Hep-2細胞株中FAK的表達為陽性。 結論：喉癌組織中FAK表達與腫瘤侵襲及轉移能力相關；喉癌Hep-2細胞株中FAK表達為陽性。 第二部分、RNAi沉默F(xiàn)AK表達對Hep-2細胞株增殖及侵襲能力的影響。 目的：構建在哺乳動物細胞中表達FAK的重組質粒FAK-pGenesil，并作用于Hep-2細胞株。探討重組質粒對Hep-2細胞株

6、FAK mRNA及蛋白的抑制作用，以及對Hep-2細胞株的增殖、侵襲能力的影響。 方法：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的FAK基因核苷酸序列(基因號GI：439874；ACCES2SION：L13616)設計的兩條多聚核苷酸序列，構建兩條干擾重組質粒FAK-pGenesil-CH1和FAK-pGenesil-CH2，并設計一條陰性對照重組質粒FAK-pGenesil-HK；在脂質體的介導下轉染喉癌Hep-2細胞株，優(yōu)化轉染條件提高

7、轉染效率；用RT-PCR和 Western Blot分析FAK mRNA及蛋白的表達；MTT法、流式細胞儀及體外侵襲實驗，測定干擾重組質粒對Hep-2細胞株的的增殖、侵襲能力的影響。 結果： (1)細胞轉染條件的優(yōu)化及細胞轉染率的觀察：當所構建重組質粒與脂質體的質量體積比為1:2.5轉染時，轉染效率最高達55％。 (2)RT-PCR及Westem blot的結果：干擾重組質粒FAKpGenesil-CH1、FAK

8、-pGenesil-CH2能使Hep-2細胞株中FAK mRNA及FAK蛋白的表達下調。FAK mRNA抑制率分別為71.54％、67.89％，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；FAK蛋白抑制率達分別為41.74％、39.38％，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 (3)MTT法、流式細胞儀及體外侵襲實驗結果： MTT顯示干擾重組質粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用于

9、Hep-2細胞株48小時后，細胞增殖抑制率分別為58.34％、52.78％，對照組為8.34％(P＜0.05)：流式細胞儀測定細胞周期顯示，干擾重組質粒FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用于Hep-2細胞株48小時后細胞增殖率為25.28％、25.67％，與對照組和正常組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；體外侵襲實驗示，F(xiàn)AK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用Hep-