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文檔簡介
1、喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤,位居頭頸部上皮源性惡性腫瘤的第2位,占全身腫瘤的1.2%~1.6%。近年來,世界多數(shù)地區(qū)喉癌的發(fā)病率及死亡率均有明顯增高趨勢,嚴重威脅著人類的健康與生命。雖然近幾十年來傳統(tǒng)的治療方式如手術(shù)、放療、化療等已有很大改進,提高了患者的5年生存率,但手術(shù)治療往往嚴重破壞患者的喉功能而致殘;放療僅對早期喉癌療效好,對于大多數(shù)就診時即為中、晚期或治療后又出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者往往效果不佳;而化療又由于其嚴重的毒、副作用
2、常使得患者不能耐受治療,從而使這些治療方式仍受到極大限制。 近年來,隨著對腫瘤發(fā)生機理研究的不斷深入,針對腫瘤發(fā)生機制多環(huán)節(jié)而起作用的新型抗腫瘤藥物不斷發(fā)展,新的抗癌藥物不斷應(yīng)用于臨床,但因存在不少急需解決的問題,其臨床應(yīng)用前景仍受到很大限制。而以在維持腫瘤的生長中起重要作用的端粒酶為靶點的端粒酶抑制劑和促進腫瘤細胞凋亡的凋亡誘導(dǎo)劑等,因其作用機制廣泛,潛在的毒性反應(yīng)較輕,已引起腫瘤研究者的廣泛關(guān)注。 組蛋白去乙酰化酶抑
3、制劑(histone deacetylase inhibitors,HDIs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的靶向抗腫瘤藥物,它主要通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙?;癄顟B(tài)來改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),進而引起相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,使腫瘤細胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細胞增殖抑制、誘導(dǎo)分化、凋亡以及端粒酶活性抑制等一系列結(jié)果而達到治療腫瘤的目的。丁酸鈉(sodium butyrate,SB)是食物纖維在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種無毒的四碳短鏈脂肪酸,是HDIs中的一類小分子化
4、合物。體外實驗證實,丁酸鈉能抑制多種腫瘤細胞增殖,誘導(dǎo)細胞分化和凋亡,并且在誘導(dǎo)凋亡過程中,還能有效地抑制細胞端粒酶活性表達,具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)。進一步研究表明,丁酸鈉對人前列腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤均有明顯的生長抑制及誘導(dǎo)凋亡作用,且對機體無明顯毒副作用。這些研究結(jié)果提示丁酸鈉有望成為一種高效、低毒的凋亡誘導(dǎo)劑和端粒酶抑制劑在腫瘤治療中發(fā)揮作用。目前對丁酸鈉抗腫瘤作用的研究已涉及消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及
5、骨腫瘤等相關(guān)系統(tǒng)腫瘤,但丁酸鈉對頭頸部腫瘤影響的報道較少,有關(guān)其對喉癌作用的研究,迄今國內(nèi)、外尚無文獻報道。隨著細胞培養(yǎng)方法的發(fā)展與普及,應(yīng)用體外培養(yǎng)的癌細胞尋找新抗癌藥物的研究已逐漸成為最重要的初篩手段之一。Hep-2為人喉上皮樣癌細胞系,因其保留了大部分人喉鱗癌的生物學特性,己被廣泛用于喉癌診斷、治療的體外研究。 為探討丁酸鈉在喉癌治療中的作用,本研究在體外培養(yǎng)Hep-2細胞的基礎(chǔ)上,采用免疫組化技術(shù)、流式細胞術(shù)及多種分子生
6、物學技術(shù)觀察了丁酸鈉對Hep-2細胞增殖、凋亡及端粒酶活性的影響并探討其發(fā)生機制,為藥物治療喉癌拓展新的思路和方法。 機體內(nèi)部環(huán)境與體外環(huán)境有著很大的差異,體外實驗結(jié)果并不能確切反映藥物在體內(nèi)對腫瘤的殺傷情況。為進一步明確丁酸鈉經(jīng)體內(nèi)代謝后對腫瘤的影響,本研究在體外實驗的基礎(chǔ)上,以Hep-2細胞株建立人喉癌裸鼠皮下移植瘤模型,應(yīng)用適當濃度的丁酸鈉進行分組治療實驗,觀察丁酸鈉的抑瘤作用以及荷瘤裸鼠的毒性反應(yīng),并探討其發(fā)生機制,為藥
7、物的開發(fā)、應(yīng)用提供有價值的實驗依據(jù)。本研究分為以下三部分。 第一部分丁酸鈉對人喉癌Hep-2細胞增殖及凋亡的影響 方法 1.采用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl terazolium,MTT)比色法測定經(jīng)0.625、1.25、2.5、5、10mmol/L丁酸鈉分別作用12、24、36、48、60、72h后Hep-2細胞增殖活性的改變,并于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。 2.應(yīng)用透射電鏡觀察
8、經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用48h的細胞超微結(jié)構(gòu)變化。 3.采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(terminaldeoxynucl-eotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling,TUNEL)技術(shù)分別檢測經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0(對照)、24、48、72h的細胞凋亡情況,統(tǒng)計細胞凋亡指數(shù)(apoptosis irldex,AI)。 4.分別
9、提取經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細胞DNA,進行瓊脂糖凝膠電泳,顯示凋亡細胞DNA片段化。 5.采用流式細胞術(shù)分別檢測經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細胞凋亡率及細胞周期分布。 6.分別制備經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h的細胞爬片,采用免疫細胞化學技術(shù)檢測細胞Ki-67抗原和Survivin蛋白表達情況。 7.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)
10、計軟件作統(tǒng)計學處理。MTT法采用兩因素方差分析加LSD法兩兩比較,TUNEL法、流式細胞術(shù)和免疫細胞化學檢測均采用單因素方差分析加LSD法兩兩比較。以α=0.05作為檢驗水準。 第二部分丁酸鈉對人喉癌Hep-2細胞端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達的影響 方法 1.采用端粒重復(fù)序列擴增(telomeric repeat amplificatiOn protocal,TRAP)-銀染法檢測經(jīng)2.5mmol/L丁酸
11、鈉作用0、24、48、72h的Hep-2細胞端粒酶活性,并應(yīng)用凝膠圖象分析系統(tǒng)對檢測結(jié)果進行半定量分析,研究丁酸鈉對Hep-2細胞端粒酶活性的影響。 2.采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chainreaction,RT-PeR)技術(shù)檢測經(jīng)2.5mmol/L丁酸鈉作用0、24、48、72h后細胞端粒酶三組分的mRNA表達情況,并對檢測結(jié)果進行半定量分析,研究丁酸鈉對Hep
12、-2細胞端粒酶三組分表達的影響,以期了解丁酸鈉影響細胞端粒酶活性的作用部位。 3.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計學處理。采用單因素方差分析加LSD法兩兩比較。以α=0.05作為檢驗水準。 第三部分丁酸鈉對人喉癌裸鼠移植瘤抑制作用的實驗研究 方法 1.選用4-6w齡BALB/C-nu/nu雌性裸小鼠12只,于裸鼠右腋部皮下接種Hep-2細胞,建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機分為對照組和實
13、驗組,每組6只,治療組每d向腫瘤組織局部注射丁酸鈉,劑量為2.2mg/g體質(zhì)量;對照組注射同體積PBS(0.01M,pH7.4)。共治療4w。 2.每d觀察裸鼠的精神、飲食及活動狀況。每w測量瘤體大小及裸鼠體質(zhì)量,繪制腫瘤生長變化曲線,進行藥物毒性評價。治療結(jié)束時處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計算抑瘤率。光學顯微鏡下觀察腫瘤及心、肝、肺、脾、腎等重要臟器變化。 3.應(yīng)用透射電鏡觀察移植瘤超微結(jié)構(gòu)變化。 4.采用TUNE
14、L 法檢測移植瘤細胞凋亡情況,統(tǒng)計細胞凋亡指數(shù)。 5.采用免疫組化技術(shù)檢測移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白表達情況,并對染色結(jié)果進行定量分析。 6.采用TRAP-銀染法檢測移植瘤端粒酶活性,并對檢測結(jié)果進行半定量分析。 7.采用RT-PCR技術(shù)檢測移植瘤端粒酶三組分mRNA表達情況,并對檢測結(jié)果進行半定量分析。 8.統(tǒng)計學處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作統(tǒng)計學處理。采用獨立樣本的t檢驗。以α
15、=0.05作為檢驗水準。 結(jié)論 本文采用免疫組化技術(shù)、流式細胞術(shù)以及多種分子生物學技術(shù)首次檢測了丁酸鈉對人喉癌Hep-2細胞及人喉癌裸鼠移植瘤的增殖、凋亡、細胞周期、Ki-67抗原、Survivin蛋白表達、端粒酶活性及端粒酶三組分mRNA表達的影響,得出如下結(jié)論: 1.丁酸鈉對Hep-2細胞具有增殖抑制作用,這種抑制作用呈時間劑量依賴性。 2.丁酸鈉對Hep-2細胞具有誘導(dǎo)凋亡作用,這種作用存在時間依賴
16、性。 3.丁酸鈉能下調(diào)Hep-2細胞Ki-67抗原表達,且呈時間依賴性。此作用可能是其抑制細胞增殖的機制之一。 4.丁酸鈉能下調(diào)Hep-2細胞Survivin蛋白表達,且呈時間依賴性。其對細胞的誘導(dǎo)凋亡作用可能是通過下調(diào)Survivin表達而實現(xiàn)。 5.丁酸鈉參與Hep-2細胞周期調(diào)控,使細胞阻滯于G0/G1期。丁酸鈉對細胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡及端粒酶抑制作用可能均與其G0/G1期阻滯有關(guān)。 6.丁酸鈉能
17、抑制Hep-2細胞hTERT mRNA表達,并下調(diào)其端粒酶活性,二者均呈時間依賴性;而對hTR mRNA和hTP1 mRNA表達無影響。提示丁酸鈉對Hep-2細胞端粒酶活性的抑制作用可能是通過下調(diào)hTERT基因表達而實現(xiàn)。 7.成功構(gòu)建了人喉癌Hep-2細胞裸鼠皮下移植瘤模型,證實丁酸鈉能抑制喉癌移植瘤生長,且對機體無明顯毒、副作用。 8.與體外實驗結(jié)果相似,丁酸鈉能下調(diào)喉癌裸鼠移植瘤Ki-67抗原和Survivin蛋白
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