HBx蛋白對(duì)正常肝細(xì)胞增殖及端粒酶活性的影響.pdf

1、研究背景：
　　 大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示，乙肝病毒(HBV)的慢性感染與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有密切的關(guān)系，HBV慢性感染是肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，然而，HBV引起肝癌的機(jī)制尚不是十分清楚，隨著對(duì)肝細(xì)胞癌和HBV研究的不斷深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)HBV中的X基因及其表達(dá)產(chǎn)物HBX蛋白在HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌的形成中起重要的作用。HBV基因組由4個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)組成，X基因是其中最小的一個(gè)ORF，它編碼的HBX蛋白由145-154個(gè)

2、氨基酸組成，分子量約為17kDa，HBX蛋白是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，從而作用于肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。肝癌細(xì)胞的無(wú)限增殖是肝癌難以控制的主要原因之一，而端粒酶的激活是細(xì)胞無(wú)限增殖的的基礎(chǔ)。研究HBX蛋白對(duì)正常肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用及其對(duì)端粒酶活性的影響具有重要的意義，可能為基于端粒酶的肝癌治療提供新的思路。
　　 目的：
　　 觀察乙型肝炎病毒X蛋白（HBX蛋白）對(duì)

3、LO2肝細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力的影響，以及HBX蛋白對(duì)LO2細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)mRNA的表達(dá)、端粒酶活性的影響。
　　 方法：
　　 1.體外培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞LO2；2.構(gòu)建PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒；3.脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒、PEGFP-N1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LO2細(xì)胞；4.倒置熒光顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EGFP的表達(dá)；5.Westernblottin

4、g檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后LO2細(xì)胞中HBX蛋白的表達(dá)；6.電子顯微鏡觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后LO2細(xì)胞的形態(tài)變化；7.MTT法檢測(cè)HBX蛋白對(duì)LO2細(xì)胞增殖速度的影響；8.RT-PCR法檢測(cè)HBX蛋白對(duì)LO2細(xì)胞hTERTmRNA表達(dá)的影響；9.TRAP-PCR銀染法檢測(cè)HBX蛋白對(duì)LO2細(xì)胞端粒酶活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HBVX基因的PEGFP-N1-HBX重組質(zhì)粒。2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HBX質(zhì)

5、粒和PEGFP-N1質(zhì)粒的LO2細(xì)胞均有EGFP熒光表達(dá)，而目的蛋白HBX蛋白僅在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒的LO2細(xì)胞中表達(dá)。3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒的LO2細(xì)胞大小不一，形態(tài)明顯幼稚化，有惡性變的趨勢(shì)。4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PEGFP-N1-HBX質(zhì)粒的LO2細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PEGFP-NI-HBX質(zhì)粒的LO2細(xì)胞hTERTmRNA表達(dá)明顯增加，端粒酶活性被激活。
　　 結(jié)論