par-4蛋白對(duì)端粒酶活性影響的研究.pdf

1、目的:探討腫瘤組織和正常組織中par-4 (prostate apoptosis response-4) 蛋白與hTERT蛋白表達(dá)和端粒酶活性表達(dá)的相關(guān)關(guān)系,以及檢測(cè)正、反義par-4基因轉(zhuǎn)染不同體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性、par-4基因表達(dá)、hTERT蛋白和端粒酶活性,探討par-4蛋白影響端粒酶活性的可能機(jī)制,為進(jìn)一步深入研究端粒酶活性調(diào)控提供線(xiàn)索.方法:1. 收集肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌組織標(biāo)本共46例,以及每一癌組織

2、標(biāo)本中相應(yīng)正常組織共46例.分別用免疫組化染色法、western blot法、RT-PCR法檢測(cè)所有組織中par-4基因的表達(dá)情況,同時(shí)用上述各種方法檢測(cè)癌組織中hTERT的表達(dá)情況,用PCR-ELISA法檢測(cè)癌組織的端粒酶活性,并且運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表達(dá)與hTERT表達(dá)和端粒酶活性的相關(guān)關(guān)系.2. 應(yīng)用分子克隆技術(shù),構(gòu)建par-4基因正義真核表達(dá)載體和par-4基因反義表達(dá)載體.用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法將par-4基因正義、反義基因真核表達(dá)載體

3、(pClneo-par-4, pcDNA3.1(-)-par-4)和兩種空質(zhì)粒載體(pc1-neo、pcDNA3.1(-))分別轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株SGC7901,肺腺癌細(xì)胞株A549,結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞和肝癌細(xì)胞HepG-2中,用G418篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆后,對(duì)轉(zhuǎn)染前后各株細(xì)胞的生物學(xué)特性、生長(zhǎng)曲線(xiàn)進(jìn)行觀(guān)察,用免疫組化染色法、western blot定量檢測(cè)法、RT-PCR半定量檢測(cè)法以及PCR-ELISA法對(duì)各株細(xì)

4、胞的par-4表達(dá)、hTERT表達(dá)、端粒酶活性進(jìn)行定性、定量檢測(cè),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以上各檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系.結(jié)果:1. Par-4蛋白廣泛表達(dá)于肺、胃、肝、結(jié)腸、直腸等組織中,在腫瘤組織中也是普遍表達(dá)的,但是在腫瘤組織中,表達(dá)水平與相應(yīng)的正常組織相比明顯降低,有顯著性差異.2. 在正常組織中,par-4主要表達(dá)于腺體細(xì)胞中、血管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中.在細(xì)胞中的分布主要表達(dá)于胞漿,可以見(jiàn)到在少數(shù)胞核中有表達(dá),但仍以胞漿表達(dá)占多數(shù).3. hTE

5、RT表達(dá)與端粒酶活性在癌組織和體外培養(yǎng)細(xì)胞中均表現(xiàn)出一致性.4. 成功構(gòu)建了par-4基因的正義和反義基因真核表達(dá)載體pClneo-par-4和pcDNA3.1(-)-par-4.5.將正、反義par-4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入肺腺癌細(xì)胞株A549,胃癌細(xì)胞株SGC-7901,肝癌細(xì)胞HepG-2和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞等4種體外腫瘤細(xì)胞中,且有效表達(dá),pClneo-par-4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中par-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高,平均到

6、達(dá)2-3倍,反義表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-par-4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,par-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低,降低到原來(lái)的20﹪~30﹪,反義基因的封閉效果達(dá)70﹪~80﹪.6. 經(jīng)G418篩選獲得的陽(yáng)性克隆中,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染正義表達(dá)載體pClneo-par-4的形態(tài)和生長(zhǎng)速度沒(méi)有明顯的改變;而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染反義表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-par-4的細(xì)胞A549、HepG2、HCT-116出現(xiàn)生長(zhǎng)速度減慢.7. Par-4蛋白表達(dá)與hTE

7、RT表達(dá)和端粒酶活性未見(jiàn)明確相關(guān)性.結(jié)論:1. Par-4蛋白在正常組織中廣泛表達(dá),在癌組織中表達(dá)有明顯減低,與正常組織相比,有顯著性差異,par-4表達(dá)降低與腫瘤是密切相關(guān)的.2. 成功構(gòu)建了par-4基因的正義和反義真核表達(dá)載體pClneo-par-4和pcDNA3.1(-)-par-4,成功的將外源性基因轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,并有效表達(dá),增加或減少par-4蛋白的表達(dá).3. Par-4蛋白的表達(dá)與hTERT的表達(dá)和端粒酶的活性