端粒端粒酶的研究進展

1、端粒、 端粒酶的研究進展,早在30年代，兩名遺傳學(xué)家Muller和Mcclintock分別在不同的實驗室用不同的生物做實驗發(fā)現(xiàn)染色體末端結(jié)構(gòu)對保持染色體的穩(wěn)定十分重要，Muller將這一結(jié)構(gòu)命名為端粒（telomere）。直到1985年Greider等從四膜蟲中真正證實了端粒的結(jié)構(gòu)為極簡單的6個核苷酸TTAGGG序列的多次重復(fù)后發(fā)現(xiàn)了端粒酶(telomerase TRAP-eze) 。,在端粒被發(fā)現(xiàn)以前，人們就推測生殖細胞之所以能世代相

2、傳，其中可能存在一種維持端粒長度的特殊機制，體細胞可能正是由于缺乏這種機制，它的染色體末端才面臨著致死性缺失（deletion）的危險。因此在正常人體細胞間永生化細胞（immortalized cells）及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化過程中可能也存在著與生殖細胞類似的機制，但這一直末予證實。十多年來對端粒和端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能有了較深入的認識。,一、人類染色體端粒及端粒酶： 1972年James Watson提出了“復(fù)制末端問題” ，復(fù)

3、制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說在線性DNA復(fù)制時，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復(fù)制。端粒DNA復(fù)制的特點是在每次DNA 復(fù)制中，每條染色體的3‘端均有一段DNA無法得到復(fù)制，隨著細胞每次分裂， 染色體3’一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA，因而細胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。 所以端粒的長度可作為細胞的“分裂時鐘”，反映細胞分裂能力。真核細胞染色體末端會隨著細胞分裂

4、而縮短，這個縮短的端粒再傳給子細胞后，隨細胞的再次分裂進一步縮短 。,隨著每次細胞分裂，染色體末端逐漸縮短，細胞進入不可逆的抑制狀態(tài)，直至細胞衰老，此過程即稱為復(fù)制性衰老。人類體細胞遵循這個規(guī)則從細胞出生到衰老，單細胞生物遵循這個規(guī)則分裂后定有其它機制保持單細胞生物傳代存活，生殖細胞亦如此，這些細胞怎樣保持細胞具有繼續(xù)分裂或長期分裂的能力呢？科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)端粒確實隨著每次分裂而縮短，但也會被新合成的端粒片斷再延長?？茖W(xué)家們懷疑，可能尚有末

5、被發(fā)現(xiàn)的酶，該酶具有標準的DNA多聚酶所不具備的功能，能使已縮短的端粒延長，使科學(xué)家們興奮的是到1985年首先在四膜蟲中證實了這種能使端粒延長的酶—端粒酶的存在。,端粒（telomere）是真核細胞線性染色體未端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由簡單重復(fù)富含G堿基的DNA序列及端粒結(jié)合蛋白共同構(gòu)成。人類染色體端粒序列已分離克隆，主要由5-15個kb的5`TTAGGG3`上千次的重復(fù)序列構(gòu)成，它就像二頂帽子蓋在染色體兩端，能保持遺傳信息的完整性，保護染色

6、體免受重組和未端降解酶的作用，并提供一種可消耗的非編碼序列以暫時緩解或取消復(fù)制問題所帶來的染色體DNA的進行性縮短。大多數(shù)體細胞的端粒隨周期性復(fù)制而逐漸縮短，最終達到一個臨界點，細胞增殖停止、死亡，這可能是生命有限的重要原因之一。,體細胞的端粒有限長度（telomere restriction fragments TRFS）大多數(shù)明顯短于生殖細胞，青年人的TRFs又顯著長于年長者，提示TRFs隨著細胞分裂或衰老，在不斷變短，主要是由于D

7、NA聚合酶不能完成復(fù)制成線性DNA末端所致。缺少端粒的染色體不能穩(wěn)定存在，這是因為端粒DNA與結(jié)構(gòu)蛋白形成的復(fù)合物如同染色體的一頂“帽子”，它既可保護染色體不被降解，又避免了端粒對端融合（end-end fusion）以及染色體的喪失，同時端粒能幫助細胞識別完整染色體和受損染色體。在生理情況下，端粒作為細胞“分裂時鐘”能縮短，最終導(dǎo)致細胞脫離細胞周期。,端粒酶（telomerase）催化端粒合成，是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為模板，

8、反向合成—TTAGGG—，不斷地加在DNA未端，腫瘤細胞能夠不斷地分裂增生，“端粒酶—RNA”結(jié)構(gòu)的存在是先決條件。 現(xiàn)認為，人的端粒酶RNA可分為兩個區(qū)與引物作用：一個是模板區(qū)，含有與引物互補的11個核苷酸模板區(qū)序列為11nt(5`CUAACCCUAAC-3’）；另一個錨定區(qū)，與引物的5’端相配，為DNA鏈向3’ 端正核酶外延伸提供路徑，而端粒酶中的蛋白質(zhì)則起催化反應(yīng)合成的作用。,人類端粒酶RNA（human telo

9、menese RNA hTR）是細胞端粒合成不可缺少的模板，若模板區(qū)突變，缺失或反義RNA可導(dǎo)致端粒的相應(yīng)改變或丟失。經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞端粒序列發(fā)生改變，細胞即出現(xiàn)凋亡或分化。hTR非模板區(qū)序列或空間構(gòu)象的變化也可使端粒酶失去活性。在胃癌及神經(jīng)腫瘤的研究中已發(fā)現(xiàn)，hTR表達與細胞增殖密切相關(guān)。端粒酶是在染色體末端不斷合成端粒序列的酶，它可以維持端粒的長度，維持細胞增殖潛能。,端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)兩部分組成。以自身RNA為模板合成端粒酶重復(fù)序

10、列，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它的活性不依賴于DNA聚合酶，對RNA酶、蛋白酶和高溫均敏感。端粒酶活性表達能穩(wěn)定端粒的長度，抑制細胞的衰老，在生殖細胞和干細胞中可檢測到高水平的端粒酶活性。,二、死亡期細胞假說與細胞永生化 細胞獲得永生必須克服兩個危機期，M1（mortality stage 1）和M2（mortality stage 2）在M1期細胞對生長因子等失去反應(yīng)，產(chǎn)生DNA合成蛋白抑制因子，細胞周期檢查點（cell cyc

11、le checkpoints）發(fā)送細胞周期停止信號，DNA合成即告停止。細胞端粒開始縮短，并啟動終止細胞分裂信號，正常人的雙倍體細胞不能進一步分裂，開始衰老、死亡。一些癌基因SV40T抗原、抑癌基因P53，和Rb突變均能使M1期的機制被抑制,使細胞逃逸M1期，繼續(xù)生長獲得額外的增殖能力，此時端粒酶仍為陰性，端粒繼續(xù)縮短，經(jīng)過20-30次分裂后，最終到達M2期。此時因端粒太短而致染色體極不穩(wěn)定，于是大多數(shù)細胞退化死亡，極少數(shù)細胞由于激活了

12、端粒酶，端粒功能得以恢復(fù)，染色體形態(tài)穩(wěn)定，可以超越M2期使細胞永生化。,端粒酶被抑制 正常人體細胞 端粒丟失 M1期阻滯

13、 SV40T抗原 細胞分裂停止 Rb、P53與病毒蛋白結(jié)合、突變 ↓ M1—M2期間隔 永生化 雙著絲粒形成 ↓

14、 M2期退化 染色體失穩(wěn) 端粒酶被激活 細胞凋亡,附圖：端粒酶在人體細胞永生性轉(zhuǎn)化中,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,三、端粒酶與腫瘤發(fā)生 端粒酶是最近腫瘤研究的熱門話題。端粒酶具有使腫瘤細胞系繼續(xù)復(fù)

15、制生存的特點，成為近期生命科學(xué)界關(guān)心與研究的一個熱點。端粒缺陷的染色體不穩(wěn)定性通過促進半合子化（hemizygosing）、轉(zhuǎn)位（tranlocation）、擴增及重組裝而加速腫瘤進程。端粒磨耗（attrition）的最終結(jié)果是端粒酶的活化，以彌補端粒的丟失而使細胞無限增殖，成為永生細胞。因此端粒酶活化是腫瘤進入晚期，而且是細胞永生的關(guān)鍵一步。,為什么在絕大多數(shù)永生細胞系可以表達端粒酶活性，而在非永生細胞則不能？

16、 為什么人類大多數(shù)體細胞中不能檢測到端粒酶，而在一些腫瘤細胞中則能檢測到端粒酶？,近年來圍繞這一問題展開了大量的研究，積累了豐富的資料，至今仍是一個值得探討的領(lǐng)域。自從1994年Kim等創(chuàng)立TRAP法檢測端粒酶活性以來，越來越多的文獻證明端粒酶活性在大多數(shù)人類原發(fā)性腫瘤標本及腫瘤衍生細胞系中可被檢測到，如前列腺癌、乳癌、口腔癌、肺癌、肝癌、胃腸基質(zhì)瘤、膀胱上皮細胞癌及AML急性髓性白血病。,Shay等報道了幾年不同學(xué)者對腫瘤端

17、粒酶探討的檢測結(jié)果，總結(jié)了正常組織（196例），原位癌（410例），惡性腫瘤（2031例）和癌旁組織（690例）的端粒酶的陽性率，它們分別是0.5%、30%、85%和11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的陽性率為85.0%~95.0%，而對應(yīng)的癌旁或良性病變組織中，端粒酶基本上不能檢出或活性極微弱。因此，盡管有研究認為，端粒長度維持還可以借助于非端粒酶依賴模式，即ALT（altematire Lengthening o

18、f telomere）機制，但其存在上并不能否認永生化細胞中端粒酶的重要作用。,美國學(xué)者在400多例來源于12 種不同組織的原發(fā)腫瘤病例中，腫瘤組織的端粒酶陽性率高達84.8％，而腫瘤周圍組織或良性病變中陽性率僅為4.4％，說明端粒酶活性與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)。 端粒酶陽性的腫瘤比陰性的腫瘤有更大的惡性傾向。通過PCR技術(shù)形成的端粒重復(fù)擴增技術(shù)檢測前列腺癌，31例中有27例（87%）有高表達的酶活性，國內(nèi)劉洪坤總結(jié)有84%前列腺癌中檢

19、測到端粒酶活性。端粒酶可能是保持前列腺癌細胞持續(xù)生長必須的酶，在細胞惡變過程中端粒酶激活是個非常重要的步驟。,有學(xué)者用鼠皮膚做模型，進行化學(xué)誘導(dǎo)致癌，分析處于乳腺癌不同階段的端粒酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌細胞是二倍體細胞，分化較好，而晚期乳腺癌則是非整倍體細胞且分化較差，同時端粒酶活性進行性增加，并伴隨著基因水平的不穩(wěn)定性。在隨后的研究中也得出了相同的結(jié)論，表明人乳腺癌的進程與端粒酶的活化密切相關(guān)，提示端粒酶可以作為診斷乳腺癌的指標。,

20、美國學(xué)者在慢性髓性白血病（CML）和急性髓性白血?。ˋML）的端粒動力學(xué)研究中，用southern印跡法測量端粒長度，用stretch-PCR法測出端粒酶活性，在CML白細胞中，端粒酶活性非常低與正常組織相似。但若CML急性發(fā)作時，白細胞中端粒酶活性就表現(xiàn)為顯著升高。表明CML由慢性到急性發(fā)作時，高度激活了端粒酶。通過對CML和AML病情進展研究，發(fā)現(xiàn)所有病例中腫瘤細胞的端粒與相應(yīng)正常細胞相比都是縮短的，這可能是由于腫瘤細胞分裂次數(shù)遠遠

21、大于正常細胞之故。,端?？s短和端粒酶激活的情況，人們稱之為端粒危機，這是腫瘤細胞克隆繁衍的強大驅(qū)動力，促進腫瘤的發(fā)展。有些實體腫瘤細胞中端粒并末縮短而是延長出現(xiàn)了矛盾的現(xiàn)象。 端粒危機的的假說有兩種解釋：1、由于大量正常細胞混跡于實體腫瘤樣品中，因而用印跡轉(zhuǎn)移分析法來檢驗端粒長度是不可信的。2、白血病與實體腫瘤細胞克隆繁衍機制不同。,許多血液學(xué)的惡性腫瘤都不會在局部形成腫瘤，細胞的增殖和循環(huán)都是單細胞的，因此每一個白血

22、病細胞都將競爭更有效的增殖，端粒酶在單個白血病細胞中的表達是強烈的，瘤細胞分裂快速，端粒縮短，使突變細胞在短期內(nèi)形成群落。與此相反實體腫瘤位于一點而不移動，因此子代對于不同突變的競爭被其緊鄰所限制。實體腫瘤中大多數(shù)成功的克隆將比白血病細胞有更穩(wěn)定的遺傳特性。因為位于特殊環(huán)境中的特殊表型必須保持相當(dāng)長的時間才能克隆形成群落，所以實體腫瘤只有具備較長的端粒，才能有較穩(wěn)定的遺傳特性，具備“最好”的表型從而被選擇，進而生長繁殖。,附表 人體

23、組織中端粒酶活性,,端粒長度是維持細胞永生所必須，從正?！愿窝住斡不伟?，端粒的長度進行性縮短，Tahara 檢測33例原發(fā)性肝癌，其中28例（84.4%）有端粒酶活性，而在肝炎和肝硬化中均有低活性的酶存在，提示端粒酶活化可能在原發(fā)性肝細胞癌癌變過程中起重要作用。,更令人感興趣的是乳腺細針穿刺標本，尿標本，膀胱和腸腔沖洗液脫落細胞的端粒酶活性檢測中惡性腫瘤也有較高的陽性表達，這可能有助于腫瘤的早期診斷。Hiyama等 對胃癌患者

24、進行端粒酶研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶陽性患者其病灶較陰性者大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也高，預(yù)后差 。,然而，端粒酶與惡性腫瘤之間是否平行還有著很大的分歧。Hiyama等研究發(fā)現(xiàn)端粒酶活性的高低與神經(jīng)母細胞瘤預(yù)后相關(guān)，高者預(yù)后差，低者預(yù)后好，在肺癌中，端粒酶活性高低與惡性度有相關(guān)性，胃癌、乳癌亦有類似的結(jié)果報告，但胃癌的端粒酶活性與腫瘤病理分級、DNA倍體、分期和預(yù)后間未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。胡震研究認為端粒酶活性與腎細胞癌的病理分級、臨床分期有正相關(guān)系，而賈瑞鵬等

25、報道認為端粒酶活性與臨床分期、病理分級無明顯相關(guān)性，由此看來，各種惡性腫瘤的端粒酶表達陽性率不同，與腫瘤的惡性度相關(guān)性也不同。,,有研究者在轉(zhuǎn)基因小鼠的模型中發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性僅在較晚期腫瘤中表達，而鼠端粒酶RNA（MTR）水平在癌前期即上調(diào)，且hTR水平與端粒酶活性并不平行[36]，Aviciion等對人腫瘤細胞株和惡性腫瘤標本的研究中也觀察到類似結(jié)果，即hTR含量高的部分細胞株不表達端粒酶活性，而后隨端粒酶增高，hTR水并不相應(yīng)增加，

26、這些結(jié)果提示端粒酶是在腫瘤進展的晚期被激活，而端粒酶RNA活性的上調(diào)是一早期事件。,基于這現(xiàn)象，在腫瘤治療方面，是否可以設(shè)計一些藥物來抑制端粒酶hTR表達的上調(diào)，減少端粒酶的活化有可能達到防治腫瘤和預(yù)防復(fù)發(fā)的目的，也有人利用反義核酸封閉hTR模板區(qū)，錘頭狀切割hTR特異序列或使hTR模板區(qū)定點突變、或改變hTR的空間構(gòu)象等，消除hTR作為模板的功能，限制其合成端粒酶的作用。,四.端粒酶與腫瘤細胞凋亡 眾所周知，細胞凋亡對

27、腫瘤有負調(diào)控作用，在惡性腫瘤的發(fā)生及演變過程中，一系列調(diào)控細胞生長與死亡的機制都發(fā)生了紊亂，包括：細胞周期的調(diào)控、信號傳導(dǎo)途徑、細胞凋亡、癌基因與抑制因的表達等，啟動凋亡的某些基因位于端粒酶結(jié)構(gòu)附近，完整的端粒結(jié)構(gòu)可以抑制這些基因的表達伴隨著細胞的分裂，正常體細胞染色體未端的端粒進行性變短，最后凋亡基因被啟動，細胞進入死亡階段。,Fu等發(fā)現(xiàn)，端粒酶具有抑制細胞凋亡的功能，且在端粒酶活性抑制的情況下，Bcl-2和Caspases抑制因子具

28、有保護細胞免受凋亡的作用。因此，具有端粒酶活性和穩(wěn)定的端粒長度的細胞，可以阻止細胞凋亡的發(fā)生。故表達端粒酶活性的惡性腫瘤細胞具有抗凋亡的能力，在腫瘤細胞內(nèi)，端粒酶的激活就是細胞凋亡機制受抑的原因之一。,五. 端粒酶與細胞周期 盡管目前有關(guān)端粒酶與細胞周期細的關(guān)系尚不清楚，但體外培養(yǎng)細胞同步化研究發(fā)現(xiàn)，細胞周期的不同階段，端粒酶的活性也不同，端粒酶活性在G1/S期進行性增加并于S期達到最大，在G2/M期活性幾乎測不到，提示

29、端粒酶維持端粒穩(wěn)定的作用，可能S期處于活化狀態(tài)，在非復(fù)制期處于靜止狀態(tài)。對細胞周期有抑制作用的藥物也能影響到端粒酶的活性。,Aldous等用抗雌激素藥物tamoxifen處理MCF-7gc癌細胞時，發(fā)現(xiàn)伴隨著MCF-7細胞周期受抑于G0/G1期，端粒酶活性也隨之下凋，但temoxifen并無直接抑制端粒酶活性的作用，Akjycma等發(fā)現(xiàn)用IFN-2處理Daudi淋巴瘤細胞，可使細胞周期停滯于G1期，端粒酶活性也明顯下降，Sharma等用

30、DMSO誘導(dǎo)人BurKitt淋巴瘤細胞Raji，可使之進入可逆的G0/G1期停滯狀態(tài)，且不伴有可檢測的分化表型改變；在此過程中，端粒酶活性呈動態(tài)改變，說明端粒酶活性的調(diào)節(jié)是細胞周期依賴性的。,有研究表明，轉(zhuǎn)染反義端粒RNA在封閉細胞的酶端?；钚员磉_的同時，伴發(fā)P21與P16表達水平的升高。P16和P21均在細胞周期的調(diào)控中起重要作用，均屬于細胞周期蛋白激酶抑制蛋白，對G1/S期轉(zhuǎn)換起負調(diào)節(jié)作用，它們通過影響CDK的活性阻止細胞進入S期，

31、P21在轉(zhuǎn)錄水平還受P53的調(diào)控，即參與細胞調(diào)亡的調(diào)控。以上提示，由于在S期細胞端粒酶的活性受到抑制，并繼發(fā)引起細胞周期蛋白激酶抑制因子P16和P21表達水平的顯著增高，從而使細胞在G1/S期轉(zhuǎn)換受阻而影響細胞從G1期過渡到S期，并有可能延長細胞周期。,六、端粒酶與腫瘤抑制基因 抑癌基因Rb，P53 ，P16可以抑制細胞周期蛋白激酶，阻滯細胞分裂 ，但這些基因單獨失活并不能誘發(fā)細胞永生。一些DNA腫瘤病毒可以使P53 ，

32、Rb基因失活，增強細胞增殖能力。在一種與突變P53基因遺傳有關(guān)的家族性癌癥綜合征Li-Fraumeni綜合征病人中，對其成纖維細胞自發(fā)性永生過程進行觀察，發(fā)現(xiàn)單純P53突變或缺失可使細胞暫時脫離衰老，但不能避免退化。,在永生化細胞IV-CF中既有P53失活，又有P16表達缺失，還有端粒延長，但缺乏端粒酶活性，提示在體內(nèi)細胞永生中還存在一種延長端粒的機制。 有些病毒蛋白具有多效性（pleiotropic effects），它

33、不僅能與Rb，P53等抑癌基因結(jié)合，而且還可能與其它未辯明的因子結(jié)合。 說明端粒酶僅是引起細胞永生的一種機制，除此以外，還有使細胞永生的其它機制，還有保持端粒長度的其它機制，有待于進一步的研究。,七、端粒酶與衰老,衰老即為老化，有生理性和病理性，生理性衰老(aging)是生物體自成熟期開始，隨年齡增長發(fā)生的，并受遺傳因素的影響，表現(xiàn)為全身復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能不可逆的退行性變化，而疾病或異常因素可引起病理性衰老（senility），是

34、衰老現(xiàn)象的提早出現(xiàn)。 Faragher指出衰老細胞逐漸積累會導(dǎo)致人體衰老的進程（但不排除其它因素），正如美國科學(xué)家戴維、施萊辛格在2002年國際人類基因組大會所說的，人的干細胞有著旺盛的活力，但是細胞有新陳代謝，隨著年齡的增長，很多功能細胞因為老化或磨損而喪失了原有的功能，然而他們卻無法被排出體外，這些“失靈”的細胞越積越多，以致最終防礙了其它細胞的“正常工作”，這很可能是人類衰老的真正因素。,對于人體衰老的延遲，一直都是人類

35、不斷追求的，端粒與端粒酶的發(fā)現(xiàn)為人類抗衰老帶來了曙光。在體外培養(yǎng)中，衰老細胞部分隨著增殖會逐漸增多。既然端粒酶活性表達能穩(wěn)定端粒的長度，那么端粒在細胞復(fù)制中就不會喪失，細胞衰老的進程就可能被阻止，從而延長壽命—這是人們研究端粒酶與抗衰老關(guān)系的熱點。 中國科學(xué)家董坦君等研究發(fā)現(xiàn)P16基因并非通過激活端粒酶，而是通過調(diào)節(jié)Rb蛋白的活性來影響端粒的長度，抑制P16基因的表達，端粒長度縮短減緩，細胞壽命延長，衰老程度減輕。

36、 Fuxe等報道P15的過度表達引起的復(fù)制性衰老方向與P16有相似的能力，同樣伴有完整的Rb蛋白途徑。,端粒酶延長端粒長度以減緩細胞衰老最早的證據(jù)來自Bodrar等的研究，1998年在Science上刊文報道：將人的端粒酶基因?qū)攵肆ｊ幮缘恼Ｈ梭w細胞中，激活其表達并培養(yǎng)細胞，然后與未導(dǎo)入該基因的細胞比較，發(fā)現(xiàn)前者端粒顯著延長，細胞分裂旺盛，細胞壽命比后者大大延長，更值得關(guān)注的是細胞并無腫瘤樣改變。另外，Targ等發(fā)現(xiàn)一些正常嚙齒

37、動物的先驅(qū)細胞有一個無限制的增殖能力，但其培養(yǎng)需在避免分化和阻止細胞循環(huán)反應(yīng)活性的前提下，Kudo等報道端粒酶活性和細胞凋亡可作為宮內(nèi)發(fā)育延遲的胎盤衰老的指標。,Maffson等認為在神經(jīng)細胞分化和存活中，端粒酶與TERT功能的測定能較好理解神經(jīng)細胞的功能，并可以促進神經(jīng)細胞在各種各樣神經(jīng)元退化性病變條件下的恢復(fù)。阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退化性老年病，其患者腦血管壁中可分離出致AD

38、神經(jīng)元退行性病變的β－淀粉樣蛋白，zhu等利用antisense技術(shù)和端粒酶抑制劑引發(fā)胎鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞中TERT的功能抑制，發(fā)現(xiàn)顯著增加了由β－淀粉樣蛋白肽引起的細胞凋亡，而在腦細胞瘤中TERT的過量表達會降低這種細胞凋亡，其原因是TERT降低的神經(jīng)細胞由于暴露于β－淀粉樣蛋白中而增強了其氧化性，并使線粒體功能發(fā)生障礙，TERT在神經(jīng)退行性病變中展現(xiàn)出神經(jīng)的保護功能，提示在神經(jīng)細胞中提高端粒酶活性可以抵止年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性病變，如A

39、D和腦老化等。,激活端粒酶可以阻止衰老的過程，延長壽命，可是一旦激活端粒酶，這些細胞將有可能成為永生化細胞，衍化成癌細胞，為避免衰老而導(dǎo)致癌癥，這顯然不是人們的初衷。但Shay等認為導(dǎo)入端粒酶的細胞不會成為癌細胞，這是因為細胞本身并未累積成為癌細胞所需的改變。不過研究的重點還是應(yīng)放在端粒酶的調(diào)控機制和細胞繁殖能力上，避免細胞無限分裂增殖而引發(fā)的腫瘤。,八、端粒酶的檢測方法 1、TRAP： Kim等在1994年

40、建立了能穩(wěn)定，成批，快速分析各組織端粒酶活性的Trap方法。在小塊組織甚至穿刺組織上提取少量組織進行端粒酶活性測定，Kim等利用PCR為基礎(chǔ)的TRAP（telomeric repeat amplification protocol）方法，包括通過改良的去污溶解手段從少量細胞中獲取富含端粒酶的提取物，然后利用端粒酶催化的引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物作為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的模板，允許產(chǎn)物呈指數(shù)擴增，建立了一種高效、特異的、敏感的端端重復(fù)擴增法（TR

41、AP），其敏感性較傳統(tǒng)擴增法提高了一萬倍。,Kim指出端粒酶在腫瘤診斷中敏感性達85%，特異性達91%，標本中少至10個癌細胞即可測得端粒酶陽性。腹水、內(nèi)鏡下、細胞刷、細針穿刺、ERCP均可測定之，較病理檢測陽性率高。此外還可應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附法（PCR-ELISA）方法及分子生物學(xué)原位雜交技術(shù)檢測端粒酶。 最近，Soriac等對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的病人通過外周血單核細胞俘獲的上皮細胞檢測出端粒酶陽性，特異性和敏感

42、性均高，且為非侵入性的方法，這為端粒酶的檢測提出了一新的途徑。,TRAP檢測方法： ①制備S-100提取液，取出-80℃凍存的待檢細胞，加20ul細胞裂解液[0.5%CHAPS,10mmol/L Tris-HCL (PH 7.5),1mmol/l MgCl2,1mmol/l EGTA,5mmol/l β-巰基乙醇，0.1mmol/l苯甲基磺酰氟，10%甘油酊]，加樣器反復(fù)吹打3次混勻，冰溶30min ，12000g 4℃

43、離心 20min，收取上清，用Folicn-酚法進行蛋白定量。-80℃保存或檢測。,② 端粒酶介導(dǎo)的端粒重復(fù)序列延伸： 取1ul S-100提取液（或取6ug蛋白質(zhì)）在50ulTRAP反應(yīng)液[20mmol/l Tris-Hcl(PH8.3), 1.5mmol/l MgCl2, 68mmol/l KCl, 0.05%Tween-20, 0.1mmol/l EGTA, 50mmol/l dNTP],含0.1ug Ts引物

44、；0.5umol/l T4g32蛋白，2u Taq DNA多聚酶，室溫30min，上述反應(yīng)均需無RNA酶操作。,③ PCR擴增端粒重復(fù)序列： 室溫延伸后加引物0.1ug,94℃ 2min 變性 94℃ 30S ， 50℃ 30S ，72℃ 30S 40個循環(huán)。 ④ 10%聚丙烯凝膠電泳，17SV 45min ,280V 105min后銀染色。,⑤銀染色： 聚丙烯凝膠電泳后，10%冰醋酸固定 20min

45、,雙蒸餾水洗 2min 3次。染色液（AgNO3lg/l,37% HCOH 1.5ml/l）中浸泡30min,雙蒸水洗15S，在顯色液（Na2CO3 30g/l,37%HCOH 0.5 ml/l Na2S2O3 5H2O 2mg/l ）中浸泡2-5min，加10%冰醋酸終止 10min，觀察結(jié)果。,2 、 Yashima等提出用存檔的石蠟病理標本以原位雜交的方法測定人類端粒酶RNA（human telonerase RNA, hTR）使

46、得回顧性研究端粒酶活性與預(yù)后的關(guān)系成為可能，但是Avilion等報告的一組資料發(fā)現(xiàn)hTR在端粒酶陽性的所有病例中都表達，而在一些端粒酶陰性的病例中也有表達，hTR與端粒酶活性并不完全吻合，所以可能認為hTR可能不是預(yù)測端粒酶活性好的指標。,九、端粒酶與腫瘤治療 由于端粒酶活性見于絕大多數(shù)惡性腫瘤，而人正常體細胞（生殖細胞、造血干細胞等除外）中未見該酶活性，使得端粒、端粒酶已成為當(dāng)今最引人注目的抗瘤治療新靶點。

47、 應(yīng)用端粒酶的拮抗劑，治療具有端粒酶活性的腫瘤細胞，限制其細胞壽命，最終導(dǎo)致細胞的特異性凋亡，這已成為癌癥治療學(xué)家關(guān)注的焦點。抑制端粒酶活性是否會導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，而達到治療腫瘤的目的呢？,目前有2個思路： ① Greider和Blackburn提出的利用反義寡核苷酸取代四膜蟲端粒酶模板區(qū)（hTR），從而阻斷端粒酶活性。根據(jù)端粒酶含有的RNA是延長端粒酶模板的特點以阻斷RNA模板，作為抑制端?；钚缘闹委煱?/p>

48、點。 ② 使端粒酶DNA發(fā)生突變，突變型的端粒酶與野生型的端粒酶競爭端粒酶蛋白，導(dǎo)致合成錯誤的端粒序列使端粒喪失功能，并能導(dǎo)致細胞死亡。,主要有以下幾方面的對策 1、阻斷端粒酶RNA的模板作用對端粒酶活性的抑制： ① 反義核苷酸、反義肽苷酸及硫代反義核苷酸對端粒酶活性的抑制，這是一些極有發(fā)展前途的癌癥治療新藥。 ② 核酶對端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸內(nèi)切酶活性的小分子RN

49、A。Kanazawa等設(shè)計了一種錘型的核酶（Telo-R2）具有特異性的切割hTR模板區(qū)的功能。核酶有望成為廣譜，低毒，高效的抗癌新藥。,2、核苷類似物對端粒酶活性的抑制 ① 底物抑制作用，即核苷類似物與端粒酶活性位點結(jié)合，形成失活的端粒酶-核苷復(fù)合物，從而抑制酶活性。 ② 核苷類似物摻入端粒DNA中，形成不穩(wěn)定的DNA-端粒酶RNA復(fù)合物，或因構(gòu)象改變而導(dǎo)致合成中的端粒DNA從端粒酶中解離。

50、 ③ 7-脫氮-dNTP阻礙鳥嘌呤四聚體等二級結(jié)構(gòu)形成，導(dǎo)致端粒合成受阻。,3、細胞分化誘導(dǎo)劑對端粒酶活性的抑制，正常人類干細胞經(jīng)過分化，端粒酶活性受到抑制，是否永生的腫瘤細胞也可通過誘導(dǎo)其分化而抑制其端粒酶活性呢？具體機制有待進一步研究。 部分腫瘤細胞有較長的端粒（>10kb）,隨細胞有絲分裂，端?？s短是個緩慢的過程，這種情況下端粒酶抑制劑是否有效尚待進一步證實。,端粒作為腫瘤的治療新靶點，目前已逐漸被重視

51、起來，但是，研究過程中也出現(xiàn)一些尚未解決的問題。在一些腫瘤細胞株中沒有酶活性的表達，提示可能有非端粒酶介導(dǎo)的端粒長度控制途徑，在臨床監(jiān)測中可能出現(xiàn)假陰性。另外，不同的瘤組織對不同的檢測手段敏感性不同，只有我們對不同腫瘤的特性有了更充分的認識，才可找到更為專一敏感、可靠的檢測方法，一旦上述的矛盾問題得以解決，腫瘤的臨床監(jiān)測與治療會取得突破性進展，不僅如此，目前尚有研究證明端粒酶與其它一些疾病包括艾滋病都有一定相關(guān)性，可以預(yù)見，隨著研究的深

52、入，端粒酶將為多種疾病的診斷與治療提供快捷、特異、副作用小的檢測新途徑。,十、研究存在的問題 端粒酶結(jié)構(gòu)與功能的辯明，對于深入理解細胞衰老，永生及癌變機制具有非常重要的指導(dǎo)作用。但是目前仍存在不少問題，有待于解決。 ①端粒酶中RNA與蛋白質(zhì)在催化或底物結(jié)合中 的確切機制； ②模板RNA與DNA引物的作用途徑； ③人類端粒酶蛋白的分離、克?。?④多數(shù)腫瘤端粒較短，端粒合成受抑后細胞可較快死亡。但少數(shù)端粒較長的腫瘤中，