端粒酶異常誘導(dǎo)肺上皮衰老的機(jī)制研究.pdf

1、在過(guò)去的20年中，隨著我國(guó)人口老齡化加劇，肺衰老相關(guān)疾病發(fā)生率和死亡率顯著上升。由于老年人生理機(jī)能衰退且暴露在含尼古丁，大氣污染和職業(yè)性粉塵的有害環(huán)境時(shí)間增加，所以是肺部疾病高度易感人群。其中特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種常見(jiàn)的慢性且高致死性的肺間質(zhì)性疾病，確診后病人的平均存活時(shí)間為3年，目前尚無(wú)有效的治療方法。IPF病人的肺結(jié)構(gòu)出現(xiàn)區(qū)域性肺上皮細(xì)胞損傷和增生、纖維化，通常伴隨

2、蜂窩狀和成纖維細(xì)胞灶的形成。IPF的發(fā)病機(jī)制尚未確定，但由組織學(xué)特征推測(cè)，肺上皮細(xì)胞損傷及異常修復(fù)可能是主要病因。肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞(alveolar epithelial typeⅡ cells，AECⅡ)是肺泡上皮干細(xì)胞，其損傷和衰老是肺上皮組織衰老的關(guān)鍵因素，與衰老相關(guān)肺病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。AECⅡ衰老的分子機(jī)制一直是肺衰老研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　第一部分 Smad7敲除引起端粒酶異常誘導(dǎo)肺上皮衰老的發(fā)生
　　肺損傷

3、初期，激活的肺上皮細(xì)胞和招募的炎癥細(xì)胞所釋放致纖維化生長(zhǎng)因子會(huì)引起損傷-修復(fù)失敗-纖維化的惡性循環(huán)。其中TGFβ是最有效的促纖維化生長(zhǎng)因子，因此TGFβ信號(hào)通路與IPF聯(lián)系緊密。但相關(guān)研究主要集中在該通路激活導(dǎo)致的肺纖維化表型及抑制該通路所得到的改善效果，對(duì)于具體機(jī)制的研究相對(duì)較少。本研究以在AECⅡ中敲除Smad7的小鼠為模型，探索了該通路與肺上皮衰老的關(guān)系及具體機(jī)制，得到以下結(jié)論:
　　1)IPF病人的肺組織中Smad7表達(dá)降

4、低。小鼠肺組織Smad7的基因轉(zhuǎn)錄水平隨年齡增加而下降。Smad7作為TGFβ信號(hào)通路的抑制因子，表明年老者TGFβ信號(hào)通路活躍增加IPF風(fēng)險(xiǎn)。
　　2)在Smad7敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)AECⅡ的細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞周期停滯，且肺上皮衰老標(biāo)志物增多，α-SMA表達(dá)增多。提示Smad7敲除可引起AECⅡ衰老，促使肺上皮組織再生修復(fù)功能受損。
　　3)AECⅡ芯片結(jié)果顯示Smad7敲除使mTert轉(zhuǎn)錄受到抑制，且肺組織AECⅡ中磷酸化

5、的Smad3入核增加，表明敲除Smad7使TGFβ信號(hào)通路激活。在肺泡Ⅱ型上皮癌細(xì)胞A549中干擾Smad7可抑制TERT的轉(zhuǎn)錄。
　　4)敲除Smad7或mTert可誘導(dǎo)小鼠肺上皮組織衰老表型。在2m、3m及8m齡的兩種敲除鼠的肺組織中p21陽(yáng)性表達(dá)的AECⅡ比例相近。
　　5)敲除Smad7可使AECⅡ端?？s短，并且引起端粒功能異常損傷灶TIF的增加，說(shuō)明TGFβ/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度并引起端粒損傷。
　　

6、6)過(guò)表達(dá)TERT可降低TGFβ1處理引起的TIF數(shù)量，提示TGFβ/Smad信號(hào)通路可能通過(guò)抑制TERT表達(dá)從而抑制端粒合成導(dǎo)致細(xì)胞端?？s短。另外敲入mTert可以部分逆轉(zhuǎn)敲除Smad7引起的肺衰老，提示Smad7敲除很可能通過(guò)抑制mTert表達(dá)誘導(dǎo)衰老表型。
　　綜上所述，Smad7敲除可以引起TGFβ信號(hào)通路激活并抑制mTert的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使得AECⅡ的端粒酶功能被抑制導(dǎo)致端?？s短并引發(fā)TIF形成，導(dǎo)致AECⅡ細(xì)胞數(shù)量減少

7、、周期阻滯，并引發(fā)肺衰老增加IPF趨勢(shì)。
　　第二部分 端粒酶缺失引起肺泡上皮干細(xì)胞衰老相關(guān)的低度慢性炎癥微環(huán)境的發(fā)生
　　前述研究表明Smad7敲除可引起mTert表達(dá)被抑制和肺上皮衰老表型，本部分重點(diǎn)以端粒酶缺失小鼠為模型，研究端粒酶介導(dǎo)的AECⅡ在肺衰老中的作用，得到以下結(jié)論:
　　1)端粒酶敲除小鼠的肺上皮衰老表征明顯增加，AECⅡ細(xì)胞呈現(xiàn)衰老表型。
　　2)TERC敲除的小鼠肺組織中AECⅡ和肺泡上皮細(xì)

8、胞數(shù)目減少。
　　3)端粒酶敲除可使AECⅡ端?？s短，引起端粒損傷，增加TIF數(shù)量。
　　4)端粒酶敲除增加肺組織中p15，p16和p21的轉(zhuǎn)錄水平。mTert敲除肺組織中p16和HP1γ陽(yáng)性標(biāo)記的AECⅡ比例明顯增加，說(shuō)明端粒酶缺失引起了AECⅡ的復(fù)制性衰老。
　　5) TERC敲除的小鼠肺組織中α-SMA和Collα1表達(dá)都有顯著增加，說(shuō)明端粒酶缺失可增加肺組織纖維化趨勢(shì)。
　　6)TERC敲除小鼠全肺中，T

9、GF-β1、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ受體轉(zhuǎn)錄水平被抑制，支氣管肺泡灌注液體中溢出的TGFβ1含量也降低，但I(xiàn)L6和CXCL15這兩種促炎因子的含量明顯升高。提示端粒酶敲除可能通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)肺上皮細(xì)胞纖維化趨勢(shì)。
　　7)端粒酶敲除小鼠的全肺中多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄激活，提示了端粒酶缺失誘發(fā)了低度炎癥反應(yīng)。
　　8)肺組織細(xì)胞懸液中單核細(xì)胞比例增加，巨噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞比例未出現(xiàn)明顯變化，提示肺組織中出現(xiàn)免疫細(xì)胞的