胚腎衰老過程端粒酶hTERT表達及調(diào)控的實驗研究.pdf

1、端粒的結構與功能與細胞衰老有密切聯(lián)系,隨著體細胞有絲分裂次數(shù)增加,端粒重復序列將逐漸丟失,導致染色體端粒長度逐漸縮短,端?？s短至一定臨界長度時,細胞便停止分裂,進入衰老期.Harley等人提出了細胞衰老的端粒假說,認為端粒長度的變化可以作為細胞有絲分裂能力的生物鐘. 端粒酶負責將端粒重復序列TTAGGG添加到染色體末端,補償了隨細胞分裂而出現(xiàn)的端粒丟失,穩(wěn)定了永生化細胞的端粒長度.端粒酶催化亞基(human TeloIIier

2、aseReverse Tanscriptase,hTERT),hTERT 具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,是決定端粒酶活性的關鍵組份. DNA甲基化作為重要的表觀遺傳修飾,通過甲基化DNA結合蛋白與改變?nèi)旧|(zhì)結構的相關因子共同作用,調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性.一般來說,高甲基化可抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄,而去甲基化可誘導癌基因的表達. 通過原代細胞培養(yǎng),建立了胚腎細胞體外快速衰老模型,并從形態(tài)學、衰老相關β-ga].染色(Senescence-a

3、ssociated β-gal,SA-β-gal.)兩方面印證了該衰老模型.接著我們從端粒長度、端粒酶活性、hTERT 基因表達角度探討了胚胎體外衰老的分子生物學機制.最后應用甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP),研究了hTERT‘基因啟動子區(qū)域的甲基化修飾水平. 研究發(fā)現(xiàn),胚腎細胞體外傳至16代出現(xiàn)明顯衰老表型,細胞體積明顯增大,形狀扁平,胞漿區(qū)域增大,細胞漿/細胞核的比例增加,胞漿

4、中可見較多顆?；蚩张?SA-β-gal染色呈現(xiàn)強陽性.該快速衰老模型的建立,為體外模擬衰老研究奠定了堅實的基礎.端粒長度的研究發(fā)現(xiàn)12代到20代,端粒長度沒有發(fā)生明顯變化,只是長度動態(tài)變異范圍增大.端粒酶活性的研究提示12代以后胚腎細胞逐漸失去端粒酶活性,16代細胞完全失去端粒酶活性,hTERT mRNA水平研究進一步印證了該結論.另外,隨著細胞走向衰老,其hTERT 基因啟動子區(qū)域出現(xiàn)甲基化修飾,DNA甲基化可能參與抑制hTERT基因