端粒酶特異性核酶抑制A549肺癌細胞端粒酶活性的實驗研究.pdf

1、端粒酶是含有RNA和蛋白質(zhì)組分的核糖核蛋白。端粒酶RNA為端粒酶合成端粒重復序列提供了模板，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是端粒酶的催化亞基。端粒酶能以自身RNA為模板合成端粒重復序列添加到染色體末端維持端粒長度從而維持染色體的穩(wěn)定性。研究結果顯示，端粒酶幾乎在人類各種惡性腫瘤中均有不同程度的表達，總的表達率在85％～90％，而在正常人體細胞幾乎不表達。由于染色體DNA末端復制問題，正常人體細胞每分裂一次，端粒就縮短50-200bp,當端粒的長度縮短到

2、一定臨界值后，染色體末端的穩(wěn)定性被破壞，導致細胞死亡。腫瘤細胞中由于端粒酶的高表達維持端粒的長度使其獲得無限增殖的能力。鑒于這一特性，端粒酶已被廣泛地應用于腫瘤診治的研究。 核酶(ribozyme)是具有酶的催化功能的RNA分子，核酶作為一種特異性抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達的工具，已在基因治療和后基因組研究領域顯示出巨大的應用前景。目前主要集中在抗病毒、抗腫瘤的研究上。應用核酶技術來抑制端粒酶活性從而抑制腫瘤細胞的增殖不失為腫瘤基因治療

3、的一種有效方法。 本研究通過設計并合成針對人端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA5’端區(qū)的錘頭狀核酶基因及針對人端粒酶RNA(hTR)模板區(qū)的錘頭狀核酶基因，分別構建表達hTERT-RZ及hTR-RZ的重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導法分別轉(zhuǎn)染入人A549肺癌細胞株，用G418篩選出表達核酶的細胞克隆，觀察比較兩種核酶對人端粒酶活性的抑制效力。對端粒酶活性下降明顯的細胞克隆進一步檢測細胞增殖和凋亡的情況，一方面驗證以端粒酶為靶點的抗癌治療

4、的可行性，為進一步應用于臨床提供研究基礎；另一方面為核酶用于肺癌的基因治療提供了實驗依據(jù)。 主要研究方法和結果： 1.分別設計并合成針對端粒酶hTERTmRNA5’端區(qū)的錘頭狀核酶基因及針對端粒酶RNA模板區(qū)的錘頭狀核酶基因，單鏈通過退火形成含EcoRI和SalI突出末端的寡核苷酸鏈，并將其分別連接到真核表達質(zhì)粒pCIneo中構建了重組質(zhì)粒pCIneo-hTERT-RZ及pCIneo-hTR-RZ。通過酶切及測序鑒定證實

5、插入載體pCIneo中的序列與設計的序列完全一致。 2.重組質(zhì)粒pCIneo-hTERT-RZ及pCIneo-hTR-RZ脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染A549肺癌細胞，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCIneo的A549肺癌細胞作為陰性對照組，未經(jīng)處理的A549肺癌細胞作為空白對照組。用G418做穩(wěn)定篩選，篩選出陽性克隆擴增培養(yǎng)。每組均獲得許多細胞克隆，隨機挑取了轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT-RZ重組體的6個細胞克隆(clonehTERT1～6)分別擴增培養(yǎng)

6、，轉(zhuǎn)染pCIneo-hTR-RZ重組體的6個細胞克隆(clonehTR1～6)分別擴增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染pCIneo質(zhì)粒的細胞克隆混合培養(yǎng)。 3.利用RT-PCR方法檢測核酶的表達，結果clonehTERT1～6、clonehTR1～6均有核酶的表達。利用RT-PCR方法檢測clonehTERT1～6、陰性對照組、空白對照組hTERTmRNA的表達水平，clonehTR1～6、陰性對照組、空白對照組hTR的表達水平。結果clonehTE

7、RT1～6hTERTmRNA的含量較空白對照組及陰性對照組明顯下降，下降最明顯的大約為空白對照組的12％，clonehTERT1～6hTERTmRNA的平均含量為空白對照組的30±19％；clonehTR1～6hTR含量較空白對照組及陰性對照組下降，下降最明顯的大約為空白對照組的32％,clonehTR1～6hTR的平均含量為空白對照組的49±17％。用TRAP法測定clonehTERT1～6、clonehTR(1、3、5)、陰性對照組

8、、空白對照組的端粒酶活性。結果陰性對照組端粒酶活性較空白對照組無明顯改變；clonehTERT1～6端粒酶活性均下降，其平均端粒酶活性是空白對照組的27±18％，且與hTERTmRNA的表達水平一致，clonehTERT1的活性下降最明顯，約為空白對照組的11％；clonehTR(1、3、5)端粒酶活性也下降，其平均端粒酶活性是空白對照組的36±13％,clonehTR3活性下降最明顯，約為空白對照組的22％。MTT法測定clonehT

9、ERT1、clonehTR3、陰性對照組、空白對照組的細胞生長曲線，clonehTERT1、clonehTR3生長較空白對照組及陰性對照組減緩，而clonehTERT1又較clonehTR3生長慢。Hochest33342染色法、流式細胞儀檢測均證實clonehTERT1(21.5％)、clonehTR3(16.1％)凋亡率比空白對照組(2.1％)及陰性對照組(5.2％)顯著增高。clonehTERT1凋亡率又比clonehTR3的凋亡

10、率高。 結論： 1.分別設計并合成針對端粒酶hTERTmRNA5’端區(qū)的錘頭狀核酶基因及針對端粒酶RNA模板區(qū)的錘頭狀核酶基因，構建了兩個錘頭狀核酶表達重組質(zhì)粒。 2.構建的核酶表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細胞后得到的細胞克隆，均可以檢測到核酶的表達。 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染核酶重組體的細胞的端粒酶活性被抑制，細胞的生長與增殖變慢，凋亡率增加。 4.實驗結果顯示兩種核酶對細胞端粒酶活性和細胞增殖的抑制效力不同，