小鼠端粒酶基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異性抗肝癌免疫的實驗研究.pdf

1、我國是肝癌發(fā)病率最高的國家之一。肝癌早期癥狀隱匿，確診時多為中晚期，手術(shù)切除并非適合所有肝癌患者。如今許多國家將肝移植列為肝臟終末期疾病的常規(guī)手術(shù)。在我國目前肝癌肝移植約占肝移植總量的1/3，只要嚴(yán)格控制肝癌肝移植的手術(shù)適應(yīng)癥，合理選擇肝移植病人，以肝臟腫瘤為適應(yīng)癥的肝移植療效可以媲美以良性終末期肝病為適應(yīng)癥的肝移植療效，但預(yù)防肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)是提高肝癌肝移植術(shù)后長期生存的關(guān)鍵。 目前常用的方法是肝移植術(shù)后盡早實施全身性的輔助

2、性化療，但肝癌細(xì)胞的高度異質(zhì)性造成肝癌細(xì)胞對傳統(tǒng)化療藥的高度耐藥，肝癌患者接受全身盲目單藥化療的有效率僅為0～17％，全身盲目化療藥聯(lián)合化療的治療有效率也僅為0～28.5％，肝癌肝移植術(shù)后盲目化療使患者受惠極少。我們的前期研究表明，肝癌肝移植術(shù)后采用個體化化療方案可使患者腫瘤復(fù)發(fā)時間延遲，在一定程度上延長生存時間，但長期療效還需進一步觀察，并且部分患者對化療藥物的副作用難以耐受。因此，如能建立針對器官移植術(shù)圍手術(shù)期腫瘤新發(fā)/復(fù)發(fā)的主動免

3、疫，不斷探索及研究新療法在肝移植圍手術(shù)期的應(yīng)用對提高肝癌肝移植術(shù)后長期生存率具有重要意義。 本研究選取廣譜、特異性靶向基因(端粒酶蛋白亞單位)，在體內(nèi)、體外兩個水平上，采用基因工程、分子生物學(xué)、流式細(xì)胞儀分析等技術(shù)，研究經(jīng)端粒酶蛋白亞單位修飾的DC提高機體特異性抗肝癌免疫，增強機體免疫系統(tǒng)對肝癌抗原的加工、遞呈及對肝癌細(xì)胞的特異性殺傷能力，為研制新型生物治療方案，解決肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)和新發(fā)的實際問題，從而提高綜合療效及長期生存

4、率提供實驗和理論依據(jù)。 第一部分：攜帶小鼠端粒酶蛋白亞單位基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建小鼠端粒酶蛋白亞單位(mousetelomerasereversetranscriptase，mTERT)基因重組腺病毒載體，為下一步研究其體外表達和動物實驗研究提供基礎(chǔ)。 方法：從肝癌細(xì)胞中提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴增mTERT的基因編碼區(qū)序列，將序列定向克隆至真核表達載體pAC，將此表達質(zhì)粒與腺病毒

5、重組質(zhì)粒pJM17共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒載體Ad-mTERT，純化后的重組腺病毒載體Ad-mTERT在293細(xì)胞大量擴增并通過氯化銫密度梯度離心法純化，測定病毒滴度。 結(jié)果：PCR及酶切證實：mTERTDNA正確克隆到穿梭質(zhì)粒pAC中，帶mTERTDNA的表達盒成功重組到腺病毒載體基因組E1A缺失區(qū)，并在293細(xì)胞中成功包裝出具有感染活性的重組腺病毒Ad-mTERT。 第二部分：小鼠骨髓來源DC的體

6、外誘導(dǎo)及AdmTERT作用于DC的生物學(xué)效應(yīng)研究目的：建立體外大量擴增樹突狀細(xì)胞(DC)的方法，并對DC進行形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)鑒定；并進一步研究AdmTERT轉(zhuǎn)染DC后對其免疫功能的影響。 方法：應(yīng)用IL-4、GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞5～7d，從形態(tài)、表型及功能上加以鑒定。用腺病毒作為介質(zhì)，將AdmTERT轉(zhuǎn)染入DC，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD11c、CD86、CD80、Iab、CD54，比較AdmTERT轉(zhuǎn)染DC前后

7、表型的變化；RT-PCR檢測腺病毒轉(zhuǎn)染DC后mTERT在DC中的表達；并與同種異體T細(xì)胞混合培養(yǎng)72h，終止培養(yǎng)前16h加入3H-TdR(0.5uCiP孔)，γ-液體閃爍儀測定cpm值，檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對同種異型T細(xì)胞的刺激能力。 結(jié)果：IL-4、GM-CSF培養(yǎng)3d可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞形狀不規(guī)則，培養(yǎng)5～6d時，有刺狀突起、拉長，為典型樹突狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征；電鏡下觀察其絕大多數(shù)為特征性星形，且有1～4級不等的樹突狀

8、突起,DC在功能上明顯刺激同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。AdmTERT轉(zhuǎn)染，DC其轉(zhuǎn)染效率可達90％以上，通過RT-PCR進一步驗證腺病毒轉(zhuǎn)染DC后mTERT在DC中呈陽性表達，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)腺病毒載體轉(zhuǎn)染DC后，對CD11、MHC-Ⅱ類分子和CD54的表達無明顯影響，但能提高DC表面共刺激分子CD80(85.6％±0.12％)、CD86(87.2％±0.25％)的表達(P＜0.05)，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對同種異型T細(xì)胞的刺

9、激能力顯著增強(P＜0.05)。 第三部分：AdmTERT致敏的DC體外誘導(dǎo)TERT陽性腫瘤特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答 目的：用攜帶mTERT基因的重組腺病毒(AdmTERT)轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞(DC)激發(fā)特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，分析CTL的特性。 方法：用AdmTERT重組腺病毒轉(zhuǎn)染小鼠體外培養(yǎng)的DC，與自體來源的T細(xì)胞混合培養(yǎng)，每隔7天進行一輪刺激，共3輪刺激，末次刺激后的7天收集細(xì)胞，使用免疫磁珠陽性分選CD8

10、+T細(xì)胞做為效應(yīng)細(xì)胞，用INF-γELISPOT法、51Cr釋放法進行特異性T細(xì)胞的檢測，探討體外是否可以誘導(dǎo)出抗原特異性的CTL。 結(jié)果：通過51Cr釋放法的檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)AdmTERT修飾的DC刺激三輪后所培養(yǎng)的T細(xì)胞能殺傷TERT陽性的小鼠肝癌細(xì)胞H22，而Ad-LacZ致敏的DC組和未致敏DC組的效應(yīng)細(xì)胞卻未顯示出明顯殺傷效應(yīng)(P＜0.05)；ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)用AdmTERT轉(zhuǎn)染DC致敏的淋巴細(xì)胞再用AdmTERT/DC

11、重復(fù)刺激時可以分泌IFN-γ，而且分泌量高于二次刺激采用無關(guān)抗原Ad-LacZ/DC或空白DC時分泌的IFN-γ(P＜0.05)。INF-γELISPOT法的結(jié)果也表明AdmTERT修飾的DC刺激后誘導(dǎo)出分泌INF-γ的特異性T細(xì)胞的數(shù)量顯著高于Ad-LacZ致敏的DC組和未致敏DC組(P＜0.05)。 第四部分：AdmTERT致敏的DC體內(nèi)誘導(dǎo)抗原特異性抗腫瘤效應(yīng) 目的：探討復(fù)制缺損型腺病毒載體介導(dǎo)mTERT修飾的樹突

12、狀細(xì)胞(DCs)在體內(nèi)誘導(dǎo)出mTERT抗原特異性的抗腫瘤效應(yīng)。 方法：選用小鼠肝癌種植模型，AdmTERT、Ad-LacZ體外致敏小鼠的BMDC，用體外致敏的DC對同系小鼠進行免疫。將32只BALB/C小鼠隨機分成4組，每組8只，每只小鼠同側(cè)后腿皮下注射1×106經(jīng)AdmTERT、Ad-LacZ致敏的同系小鼠的BMDC，另設(shè)DC組、PBS組，然后于第7d和第14d分別強化注射1次，劑量同上。距最后一次免疫14d后取脾細(xì)胞行51C

13、r釋放實驗，檢測特異性CTL殺傷活性；給免疫小鼠接種H22肝癌細(xì)胞，觀察腫瘤大小及荷瘤小鼠成活情況。為盡可能模擬臨床的情況，進一步驗證在腫瘤存在的情況下，AdmTERT修飾的DCs是否能夠有效抑制腫瘤生長。在每只小鼠后右側(cè)背部皮下接種處于對數(shù)生長期的H22細(xì)胞，劑量為1×106細(xì)胞/只。上述小鼠接種H22腫瘤細(xì)胞后三天，按接受治療不同，將32只BALB/C小鼠隨機分成4組，每組8只，實驗分組及免疫方法同上。治療期間每隔兩天觀察腫瘤出現(xiàn)及

14、生長情況。 結(jié)果：AdmTERT致敏DC免疫BALB/C小鼠產(chǎn)生了抗原特異性的Th1型免疫反應(yīng)，其中AdmTERT組IL-2的水平和INF-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量顯著高于Ad-LacZ組(P＜0.05)；同時DC組脾細(xì)胞分泌IL-2的水平和INF-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量未見升高，而PBS組小鼠脾細(xì)胞不能顯著誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2和INF-γ；AdmTERT修飾的DCs誘發(fā)小鼠產(chǎn)生特異性的CTL，AdmTERT修飾的DCs能誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生，

15、其CTL對靶細(xì)胞的殺傷效率與E∶T比例成正比。在相同的E∶T比例下，AdmTERT/DCs誘發(fā)產(chǎn)生CTL殺傷率明顯地強于Ad-LacZ/DCs，而未致敏的DC免疫組和PBS組的效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞沒有明顯殺傷活性，表明用Ad介導(dǎo)mTERT修飾DCs能更有效地誘發(fā)針對mTERT的抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)；AdmTERT修飾的DCs免疫提高了小鼠的存活率，PBS組和未處理DCs組腫瘤生長迅速，小鼠1-2周內(nèi)全部有腫瘤生長；Ad-LacZ/DCs組

16、腫瘤生長似乎稍有延遲，但2-3周內(nèi)全部有腫瘤生長；AdmTERT/DC組每只小鼠接種1×106H22細(xì)胞后觀察2個月仍有40％的小鼠無瘤生長。觀察至第27天時，此組中出現(xiàn)腫瘤生長的小鼠的腫瘤平均直徑明顯低于各對照組小鼠的腫瘤平均直徑(P＜0.05)。Ad-LacZ/DCs組、PBS組和未處理DCs組免疫的小鼠在荷瘤第28天至第67天之間全部死亡，而在第60天，AdmTERT修飾的DCs組的小鼠存活率為62.5％，觀察到第90天，此組小鼠

17、的存活率仍為37.5％，且存活小鼠體內(nèi)未觀察到有腫瘤生長，表明AdmTERT修飾的DCs免疫小鼠，可以顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長，而且提高小鼠的存活率。 結(jié)論：1.成功構(gòu)建出攜帶小鼠端粒酶蛋白亞單位(mTERT)基因的重組腺病毒載體(AdmTERT)，為研究其用于腫瘤的基因治療奠定基礎(chǔ)。 2.通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)出樹突狀細(xì)胞，并分別從形態(tài)、表型及功能上加以證明。AdmTERT轉(zhuǎn)染DC能提高DC表面共刺激分子CD80、CD86的