樹突狀細(xì)胞-食管癌融合疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞特異性抗人食管癌免疫反應(yīng)研究.pdf

1、第一部分樹突狀細(xì)胞/食管癌細(xì)胞融合疫苗誘導(dǎo)特異性抗食管癌免疫反應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)研究。 背景與目的： 樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是人體專職的抗原呈遞細(xì)胞，以DCs為基礎(chǔ)的DC/腫瘤細(xì)胞融合疫苗可以有效地誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，本研究旨在探討成熟的DCs與人食管癌細(xì)胞株EC109細(xì)胞融合疫苗的制備及其體外誘導(dǎo)特異性抗食管癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。 材料和方法： (1)采用Ficoll-Hypa

2、que密度梯度法，從健康志愿者外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在重組人粒/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Recoml)inant human granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor，rhGM-CSF)和白介素(Interleukin-4，IL-4)作用下體外誘導(dǎo)分化成熟的DCs。 (2)采用聚乙二醇(po

3、lyethylene glycol，PEG)化學(xué)融合法使成熟DCs與EC109細(xì)胞按5∶1比例融合制備DC/EC109細(xì)胞融合疫苗。 (3)FITC標(biāo)記的CD86單抗和PE標(biāo)記的MuC1單抗對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行雙色熒光免疫染色，流式細(xì)胞率檢測(cè)同時(shí)表達(dá)CD86和MUC1抗原的細(xì)胞的比率，即成功融合細(xì)胞的比率。 (4) 分別以融合細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及DCs作為刺激細(xì)胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT)試驗(yàn)檢測(cè)其刺激T淋巴細(xì)胞的增殖活性，并比較

4、三組T淋巴細(xì)胞的增殖活性。 (5) 分別以融合細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及DCs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Tlymphocytes，CTLs)作為效應(yīng)細(xì)胞，以EC109細(xì)胞作為靶細(xì)胞，乳酸脫氫酶(LDH)試驗(yàn)檢測(cè)三組效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用并進(jìn)行比較。 (6) 以融合細(xì)胞誘導(dǎo)的CTLs作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以EC109細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞株SGC7901及人乳腺癌細(xì)胞株MCF7作為靶細(xì)胞，LDH試驗(yàn)檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)三組靶

5、細(xì)胞的殺傷作用并進(jìn)行比較。 結(jié)果： (1) 成熟的DCs與EC109細(xì)胞的平均融合率為22.25﹪。 (2) DC/EC109細(xì)胞融合疫苗能有效地刺激T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，在刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例相同的情況下，DC/EC109融合細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)明顯高于DCs或ECl09細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且融合細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力隨著刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例的增加

6、而增強(qiáng)。 (3) 效靶比相同時(shí)，經(jīng)DC/EC109融合細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs對(duì)EC109細(xì)胞的殺傷率顯著高于腫瘤細(xì)胞組和DCs組誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs的殺傷率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著效靶比的增加，所產(chǎn)生的CTLs對(duì)EC109細(xì)胞的殺傷活性也隨之增強(qiáng)。 (4) 融合疫苗誘導(dǎo)的CTLs對(duì)EC109細(xì)胞的殺傷作用顯著強(qiáng)于對(duì)SGC7901細(xì)胞及MCF7細(xì)胞的殺傷作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論

7、： (1) 采用PEG化學(xué)融合法可以在體外成功融合成熟的DCs與EC109細(xì)胞，制備DC/EC109細(xì)胞融合疫苗。 (2) DC/EC109細(xì)胞融合疫苗能有效地在體外誘導(dǎo)抗原特異性CTLs。 (3) DC/食管癌融合疫苗誘導(dǎo)的CTLs可以有效地產(chǎn)生抗食管癌EC109細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，表明融合細(xì)胞疫苗在食管癌的治療上可能具有一定的臨床應(yīng)用前景。 第二部分樹突狀細(xì)胞/食管癌融合疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性CTLs

8、對(duì)人食管癌裸鼠移植瘤的生長抑制作用及生物學(xué)影響。 背景與目的： 食管癌的發(fā)病率和死亡率在我國均居惡性腫瘤的第四位，是嚴(yán)重危害我國人民健康和生命的疾病，目前的綜合治療手段療效有限，需探索能夠有效治療食管癌的其他治療手段。腫瘤的生物免疫治療目前被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療、化療之后對(duì)腫瘤具有確切效果的又一治療方法，而其中樹突狀細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞融合疫苗在抗腫瘤免疫中起著極其重要的作用。本研究旨在證實(shí)DC/腫瘤細(xì)胞融合疫苗誘導(dǎo)的抗原特異性

9、CTLs對(duì)食管癌細(xì)胞的體內(nèi)特異性殺傷作用，探討抗原特異性CTLs對(duì)移植瘤的生長抑制作用及對(duì)移植瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，為DC/食管癌細(xì)胞融合疫苗的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 材料和方法： (1) 常規(guī)培養(yǎng)食管癌EC-109細(xì)胞，收集處于對(duì)數(shù)生長期的EC-109細(xì)胞，用生理鹽水配成2×10<'7>/ml瘤細(xì)胞懸液，無菌條件下用注射器抽取瘤細(xì)胞懸液0.5 ml接種于裸小鼠右側(cè)腋部皮下使之荷瘤。 (2) 采用Ficoll-Hy

10、paque密度梯度法，從健康志愿者外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，在細(xì)胞因子rhGM-CSF和IL-4作用下體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)成熟的DCs，同時(shí)收集并培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞。 (3) 采用PEG化學(xué)融合法使成熟DCs與EC109細(xì)胞按5∶1比例融合制備DC/EC109融合疫苗。 (4) 以DC/EC109融合細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(Stimulators，S)，T淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞(Resporlders，R)，按S∶R=100∶1混勻以誘

11、導(dǎo)CTL<,s>并采用尼龍毛柱分離法純化激活的T淋巴細(xì)胞。 (5) 將成功荷瘤的裸鼠隨機(jī)分成A、B、C三組。A組(n=10)以融合細(xì)胞誘導(dǎo)的CTLs瘤內(nèi)注射進(jìn)行免疫治療，B組(n=11)以未激活的T淋巴細(xì)胞瘤內(nèi)注射進(jìn)行免疫治療，C組(n=11)以無血清RMPI-1640培養(yǎng)液瘤內(nèi)注射作為空白對(duì)照組。每周注射1次，共4次。 (6) 每周測(cè)量各組裸鼠移植瘤的最大徑及最小徑，計(jì)算各組腫瘤平均體積，繪制各組腫瘤組織生長曲線，4周

12、后用頸椎脫位法處死動(dòng)物，剝離原位腫瘤，測(cè)量各組腫瘤的體積及濕重，比較各組腫瘤的平均體積和平均濕重。 (7) 取移植瘤組織經(jīng)10﹪甲醛固定脫水、石蠟包埋切片、HE染色作常規(guī)病理檢查，并采用免疫組化S-P法，檢測(cè)全部裸鼠移植瘤PCNA的表達(dá)情況，用PCNA標(biāo)記指數(shù)(PCNALabel Index，PCNA-LI)表示PCNA陽性細(xì)胞所占比例，比較各組腫瘤細(xì)胞的平均PCNA-LI。 (8) 取新鮮腫瘤組織剪碎后制成單細(xì)胞懸液，

13、以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。以S期細(xì)胞百分比(S-phase fraction，SPF)表示細(xì)胞的增殖活性，比較各組腫瘤細(xì)胞的平均SPF值以及平均細(xì)胞凋亡率。 (9) 分別取移植前體外培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)期生長的食管癌細(xì)胞株EC-109細(xì)胞及C組移植瘤組織單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞表面MUC1抗原的表達(dá)。 結(jié)果： (1) 共有33只裸小鼠荷瘤成功，總的成瘤率為82.5﹪，第一次免疫治療后A組裸小鼠意外

14、死亡1只。 (2) 從腫瘤的生長曲線可見，治療開始后，三組腫瘤的平均體積差異逐漸明顯，治療結(jié)束時(shí)A組腫瘤的平均體積明顯小于B、C兩組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3) 治療結(jié)束后A、B、C三組腫瘤的平均體積分別為(881.45±31.14)mm<'3>、(1493.37±51.67)mm<'3>、(2065.77±87.55)mm<'3>，A組腫瘤的平均體積明顯小于B、C兩組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

15、三組腫瘤的平均濕重分別為(0.88±0.04)g、 (1.38±0.07)g、(2.04±0.11)g， A組腫瘤的平均濕重明顯低于B、C兩組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4) 移植瘤組織病理學(xué)檢查見A組腫瘤中可見大量凋亡的腫瘤細(xì)胞，腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤明顯，而C組腫瘤則瘤細(xì)胞豐富、生長旺盛，呈浸潤性生長，腫瘤組織中淋巴細(xì)胞浸潤少。 (5) 免疫組織化學(xué)染色可見PCNA在各組移植瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，A、B、C三

16、組腫瘤的平均PCNA標(biāo)記指數(shù)分別為(26.83±0.95)﹪、(51.82±1.51)﹪、(68.93±2.40)﹪。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，A組PCNA標(biāo)記指數(shù)明顯低于B、C兩組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (6) A、B、C三組腫瘤的細(xì)胞周期SPF分別為(12.46±0.36)﹪、(29.39±0.96)﹪、(42.25±1.43)﹪，比較三組腫瘤細(xì)胞周期的SPF，可見A組SPF值明顯低于B、C兩組(P<0.05)，差異有統(tǒng)

17、計(jì)學(xué)意義。A、B、C三組腫瘤細(xì)胞的平均凋亡率為分別為(38.03±1.21)﹪、(17.75±0.56)﹪及(6.59±0.22)﹪，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明細(xì)胞平均凋亡率明顯高于B、C兩組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (7) 食管癌細(xì)胞株EC-109細(xì)胞MUC1表達(dá)率為99.3﹪，C組裸鼠移植瘤細(xì)胞表面抗原MUC1的平均表達(dá)率為97.5﹪，兩者基本一致。 結(jié)論： (1) 本研究成功建立了人食管癌EC～109細(xì)胞裸鼠皮下移