樹突狀細(xì)胞體外刺激對hbv特異性細(xì)胞毒t細(xì)胞影響的研究

1、研究背景,HBV慢性感染主要原因,,HBV特異細(xì)胞免疫功能的低下,,,,,T細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞（DC）,慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能異常,研究背景（1）,特異性CTL數(shù)量少低反應(yīng),,,,,HBV慢性感染主要原因,,HBV特異細(xì)胞免疫功能的低下,,,,,T細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞（DC）,慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能異常,促進(jìn)DC成熟、恢復(fù)DC的功能,,增強(qiáng)DC激活特異性抗病毒免疫反應(yīng),,打破免疫耐受徹底清除病毒,,研

2、究背景（1）,特異性CTL數(shù)量少低反應(yīng),,,,,,獲得高頻數(shù)、功能強(qiáng)HBV特異性的CTL,促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)DC功能,CpG,CD40L,Ad-IL-12轉(zhuǎn)染,Poly（I：C）,,,,,,,關(guān)于恢復(fù)DC功能的研究,研究背景（2）,研究目的,本研究通過在體外進(jìn)行慢性乙型肝炎患者單核細(xì)胞的DC方向轉(zhuǎn)化，并輔以聚肌胞Poly(I:C)刺激，增強(qiáng)DC的成熟和功能。將患者DC經(jīng)HBV core18-27肽負(fù)載后，刺激病人自身的T淋巴細(xì)

3、胞。并用Elispot法及本研究室構(gòu)建的HLA-A2肽四聚體復(fù)合物檢測病毒特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能。,研究對象和方法,研究對象,22例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。HBeAg+患者16例、 HBeAb+患者6例。HBV DNA 均≥104 copy/ml。排除HCV、HAV、HDV、HEV感染。近半年沒有接受過抗病毒治療。,研究方法,HLA-A2型別鑒定 DC的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定 以樹突狀細(xì)胞為抗原遞呈細(xì)胞體外誘導(dǎo)病毒

4、抗原特異性T細(xì)胞 Elispot檢測分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù) MHC-肽四聚體檢測 HBVcore18-27 肽特異性CD8 + T 細(xì)胞,HLA-A*02型別鑒定,外周血淋巴細(xì)胞標(biāo)記鼠抗人HLA-A02單抗；流式細(xì)胞儀檢測；每份標(biāo)本均設(shè)自身陰性對照。,樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定,分離病人PBMC；GM-CSF、IL-4 刺激下DC培養(yǎng)轉(zhuǎn)化；Poly( I:C)刺激；通過流式細(xì)胞儀檢測DC的HLA-DR

5、、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表達(dá)，進(jìn)行功能及成熟度的鑒定。,以DC為抗原遞呈細(xì)胞體外誘導(dǎo)HBV抗原特異性T細(xì)胞,培養(yǎng)成熟DC負(fù)載HBV 核心肽（HBV core18-27 FLPSDFFPSV）；DC與自體T細(xì)胞共培養(yǎng)48-72h；單純IL-2維持未經(jīng)自身樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞組為對照。,Elispot檢測分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù),封閉種板 孵育：37℃，5% CO2 孵育15-2

6、0 h；顯色計數(shù)：CTL IMMUNOSPOT分析儀計數(shù)，取兩復(fù)孔的平均值,MHC-肽四聚體檢測 HBVcore18-27 肽特異性CD8 + T 細(xì)胞,PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記；流式細(xì)胞儀檢測；慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV 四聚體標(biāo)記作為陰性對照；,統(tǒng)計學(xué)處理,實驗數(shù)據(jù)以?x±SD表示。用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分

7、析，組間比較用配伍組方差分析。,結(jié) 果,DC的擴(kuò)增、表型鑒定及Poly (I:C)對其表面分子表達(dá)的影響,慢性乙型肝炎病人DC經(jīng)Poly (I:C)作用前后表面分子表達(dá)的比較 *表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）,經(jīng)Poly(I:C)刺激后： CD80、CD83表達(dá)明顯上調(diào)。CD14的表達(dá)明顯下降 。,Poly(I:C)對DC表面分子表達(dá)的影響,Elispot檢測HBV特異性的分泌IFN-γ 的CTL細(xì)

8、胞頻數(shù)的比較,1 2 31.慢乙肝病人體外經(jīng)IL-2維持生長的T細(xì)胞；2.經(jīng)自體DC刺激后的T細(xì)胞；3.DC經(jīng)Poly（I:C）作用后刺激的T細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞激活的分泌IFN-γ的CTL細(xì)胞的頻數(shù)分布圖,T：慢性乙型肝炎患者體外經(jīng)IL-2維持生長的T細(xì)胞；DC-T：經(jīng)樹突狀細(xì)胞刺激后的T細(xì)胞；PDC-T：樹突狀細(xì)胞經(jīng)Poly（I:C）作用后刺激的T

9、細(xì) （“━”表示均數(shù)）,Elispot檢測結(jié)果說明,病人T細(xì)胞在經(jīng)自體樹突狀細(xì)胞刺激后與未刺激前相比，分泌IFN-γ 的CTL細(xì)胞頻數(shù)均值由16上升為46，約為2.9倍；發(fā)現(xiàn)經(jīng)Poly（I:C）作用后的樹突狀細(xì)胞所活化的特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞頻數(shù)明顯升高，均值為98，和未經(jīng)樹突狀細(xì)胞刺激組和樹突狀細(xì)胞刺激組相較，分別升高6.1和2.1倍。,Tetramer 流式細(xì)胞技術(shù)檢測HBVcor

10、e18-27 特異性CD8 + T 細(xì)胞結(jié)果,PE-HLA-A0201/HBVcore 18-27 tetramer 和FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記T細(xì)胞，行流式檢測。以淋巴細(xì)胞設(shè)門，收集門內(nèi)細(xì)胞50,000個, 右上象限細(xì)胞數(shù)/右上及右下象限細(xì)胞數(shù)之和即為抗原特異性CTL占CD8+細(xì)胞數(shù)比例（圖中右上象限的百分比值）。,1．PE-羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人CD8標(biāo)記的T細(xì)胞；2. IL-2維持的自身T細(xì)胞；3.與樹突狀細(xì)

11、胞作用的T細(xì)胞；4.與poly（I︰C）刺激后的樹突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞,圖3. tetramer檢測特異CD8 + T 細(xì)胞的頻數(shù)分布圖,Control：非相關(guān)肽四聚體標(biāo)記的T細(xì)胞； T：IL-2維持的自身T細(xì)胞；DC-T：與樹突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞；PDC-T：與poly（I︰C）刺激后的樹突狀細(xì)胞作用的T細(xì)胞。,Tetramer 結(jié)果說明,患者T細(xì)胞在經(jīng)自體樹突狀細(xì)胞刺激后與未刺激前相比， HBV core18-27 肽特異

12、的CTL頻數(shù)均值由0.77 %上升至1.92%，提高約2.5倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（ P ＜0.001）。經(jīng)Poly（I:C）刺激的樹突狀細(xì)胞活化后，HBVcore18-27 表位特異性CTL的頻數(shù)均值上升為3.49 %，分別為前2組的4.5和1.8倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均小于0.001）。,討 論,討論（1）,樹突狀細(xì)胞能激活幼稚T細(xì)胞，調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞的功能；在病毒抗原攝取、遞呈及特異性激活抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作

13、用，是抗感染免疫的中心環(huán)節(jié)。 HBV急性感染時：多克隆、高反應(yīng)性的病毒特異性CTL——可迅速、徹底清除病毒；HBV慢性感染時：單一克隆、弱反應(yīng)性的病毒特異性CTL。,討論（2）,聚肌胞Poly(I:C)是一種Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的強(qiáng)誘生劑。 Poly（I:C）能夠有效地誘導(dǎo)體外單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的樹突狀細(xì)胞成熟，并維持樹突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài) 。 CD83：DC成熟；行使功能CD83表達(dá) DC成熟及功能改

14、善 CD14：單核細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記CD14表達(dá) DC分化程度改善,,,,,討論（3）,MHC-肽四聚體染色法檢測HBVcore18-27 特異性CTL的數(shù)量： 高特異性、敏感性 對特異性CTL進(jìn)行定性、定量分析 用于感染、腫瘤、自身免疫性疾病等的細(xì)胞免疫學(xué)研究和治療效果監(jiān)測。Elispot 檢測活化的分泌IFN-γ的有功能的病毒特異性T細(xì)胞兩種技術(shù)結(jié)合 能夠更準(zhǔn)確、客