特異性表達(dá)Her-2抗原樹(shù)突狀細(xì)胞治療肺癌的體外研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建特異性表達(dá)Her-2的慢病毒載體，探索慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染DCs后誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化增殖能力和其抗腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)，并對(duì)比其與單純DCs誘導(dǎo)CIK殺傷Her-2陽(yáng)性肺癌的能力差異。
　　方法：
　　1．構(gòu)建表達(dá)Her-2基因的慢病毒載體：以pcDNA3.1-ERBB2-EGFP為模板，設(shè)計(jì)含Not I和Xba I酶切點(diǎn)引物，PCR法擴(kuò)增ERBB2基因片段，T4連接酶連接慢病毒制備表達(dá)Her-2基因的慢病毒質(zhì)粒，

2、感受態(tài)細(xì)胞單克隆復(fù)制挑選表達(dá)Her-2基因的慢病毒，PCR法鑒定克隆產(chǎn)物的正確性，293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，36h后收集上清液即可獲得表達(dá)Her-2的慢病毒載體顆粒，密度梯度稀釋法檢測(cè)病毒滴度。
　　2．制備表達(dá)Her-2蛋白的DC疫苗：收集人外周血液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞，通過(guò)IL-4， GM-CSF等細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)，制備DCs。在DCs培養(yǎng)第5天分別加入攜帶Her-2基因慢病毒載體和空載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染（MOI=10），第6天加入腫瘤壞死因

3、子α刺激成熟，第8天收集DCs。顯微鏡下查看病毒感染DCs后綠色熒光呈現(xiàn)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后成熟DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表達(dá)情況，并與傳統(tǒng)單純DCs和空載體DCs進(jìn)行比較。
　　3．檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況：利用CD3、IL-2等因子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞，制備CIK疫苗。當(dāng)培養(yǎng)至第8日時(shí)，分別與LV-Her2-DCs、LV-DCs和單純DCs共培養(yǎng)，以刺激CIK增殖活化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK

4、表面CD3/56表達(dá)情況，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm下OD值，判斷三組CIK增殖情況。
　　4．體外殺傷腫瘤細(xì)胞：免疫組化挑選一株表達(dá)Her-2的肺癌細(xì)胞，將三組DC-CIK和Her-2陽(yáng)性肺癌細(xì)胞分別以10:1、20:1、40:1的效靶比共培養(yǎng)殺傷48小時(shí)，CCK8法檢測(cè)三組DC-CIK疫苗的殺傷能力。
　　結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建編碼Her-2基因的慢病毒載體，顯微鏡下可見(jiàn)293T細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，提示目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞

5、。病毒滴度為：2 x108TU/ml。
　　2．成功培養(yǎng)特異性表達(dá)Her-2的DC疫苗，當(dāng)MOI=10時(shí)，空載體病毒和含Her-2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染DC后細(xì)胞表面綠色熒光蛋白表達(dá)率分別為40.2％和41.8%，兩組DC感染率無(wú)明顯差異（p=0.293），提示攜帶Her-2基因并不影響慢病毒轉(zhuǎn)染能力。DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表達(dá)量提示DC成熟，轉(zhuǎn)染病毒后不影響DC分化成熟能力。
　　3．成功從外周血中獲取單個(gè)

6、核細(xì)胞進(jìn)行CIK培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，易集群，流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示三組CIK表面CD3/56因子均有表達(dá)， LV-Her2-DC誘導(dǎo)CIK活化增殖能力約為L(zhǎng)V-DC或單純DC的2倍（p=0.00）。其中，LV-DC和單純DC誘導(dǎo)CIK增殖能力無(wú)明顯差異（p=0.06），LV-Her2-DC誘導(dǎo)CIK增殖能力與單純DC對(duì)照組相比較具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.007）。
　　4．免疫組化結(jié)果證實(shí)A549肺癌細(xì)胞株呈弱且不完

7、整的胞膜著色；應(yīng)用CCK8試劑盒檢測(cè)LV-Her2-DC-CIK實(shí)驗(yàn)組在以10:1、20:1、40:1的效靶比對(duì)A549肺癌細(xì)胞株的殺傷能力，殺傷率依次為：26.9%、43.8%、52%。明顯高于單純DC-CIK對(duì)照組的殺瘤率（P＜0.05），而LV-DC-CIK空載體組與單純DC-CIK對(duì)照組的殺瘤率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．本研究構(gòu)建重組Her-2基因片段的慢病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染DCs。