Bcr-abl特異性樹突狀細胞瘤苗的構建.pdf

1、中山大學碩士學位論文Bcrabl特異性樹突狀細胞瘤苗的構建姓名：胡元申請學位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學指導教師：黃仁魏20060601中山大學碩士學位論文Dc的轉染率可高達40％～60％，并穩(wěn)定、持續(xù)表達目的基因，誘導出特異性CTL活性。目前常用的逆轉錄病毒載體多由Moloney小鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus：MoMLV)改建而來，保留了順式功能結構，剔除了DNA基因結構中的gag、pol、env=部分

2、致病性反式功能序列，并以外源基因替代空白區(qū)，故為缺陷病毒，所缺陷的逆轉錄病毒的結構基因區(qū)由缺失包裝信號(Ⅲ)的包裝細胞反式供給，這樣可防止與逆轉錄病毒之間的重組而產(chǎn)生完整的病毒基因組造成機體損害。本課題的前期研究已總結出體外從外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuelearcell：PBMC)誘導分化Dc的成熟技術。本研究通過克隆ber／abl基因，連接表達缺陷的逆轉錄病毒，構建bcr／abl重組表達載體，逆轉錄病

3、毒介導bcr／abl融合基因轉染臍血干細胞來源DC，構建Bcr／abl特異性DC瘤苗，為進一步的DC瘤苗抗CML研究打下基礎。材料與方法一bcr／abl融合基因逆轉錄病毒載體的構建1引物設計根據(jù)pGD210全長ber／abl融合基因序列設計1對引物用于擴增誘導特異CTL所需bcr／abl融合位點兩側的基因序列。2bcr／abl基因片段的合成1)K562細胞株的培養(yǎng)：用含10％小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液于37℃、5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)

4、常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液。2)從K562細胞提取總RNA：收集5106個K562細胞，Trizol法從K562細胞提取總RNA，電泳檢測并核酸蛋白分析儀NoD值定量RNA濃度。3)RT—PCR擴增bcr／abl片段：逆轉錄合成eDNA，以eDNA為模板，用bcr／abl特異引物進行PeR擴增得到含BarnHI、＆。RI雙酶切位點的490bp大小的bcr／abl片段，電泳檢測并核酸蛋白分析儀NoD值、濃度。3提取載體pLXSN質(zhì)粒于瓊脂平板上挑