熱休克腎癌細胞凍融瘤苗特異性殺傷效應(yīng)的研究.pdf

1、目的：研究熱處理腎癌細胞后制備的凍融抗原負載樹突狀細胞(DC)體外誘導(dǎo)、活化細胞毒性T細胞(CTL)特異性殺傷腎癌細胞的效應(yīng)及其機制，為晚期腎癌的治療提供一種簡便有效的新途徑。 方法：①786-0腎癌細胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞以備實驗。②利用密度梯度離心法從健康人外周血中分離出單個核細胞(PBMC)，短暫培養(yǎng)后的貼壁細胞應(yīng)用GM—CSF、IL—4聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，第5天加入TNF-α。(2)熱應(yīng)激和反復(fù)凍融786-0

2、腎癌細胞制備熱休克腫瘤細胞凍融抗原，在第6天加入至培養(yǎng)瓶中得到的DC記為HSAg—DC組；反復(fù)凍融786-0腎癌細胞制備單純腫瘤細胞凍融抗原，在第6天加入至培養(yǎng)瓶中得到的DC記為Ag—DC組；在第6天只加入PBS而得到的DC記為non—DC組。(3)DC培養(yǎng)的第2天、第5—6天、第7—8天應(yīng)用光鏡對DC進行形態(tài)學(xué)鑒定；DC培養(yǎng)的第3—4天、第7—8天應(yīng)用掃描電鏡對DC進行形態(tài)學(xué)鑒定。(4)DC培養(yǎng)的第7—8天用流式細胞儀(FCM)測定H

3、SAg—DC組和Ag—DC組CD1a、CD83、CD80、CD86、四種表面分子的陽性表達率。③將PBMC短暫培養(yǎng)后的懸浮細胞通過尼龍毛柱法獲得T淋巴細胞，加入IL—2培養(yǎng)至T淋巴細胞成熟。(2)將培養(yǎng)至第8天的3組DC與T細胞按20：1的效靶比混合培養(yǎng)，獲得三組CTL，分別記為HSAg—DC—CTL組、Ag—DC—CTL組、non—DC—CTL組。④將3組CTL與腎癌細胞以不同的效靶比(10：1、20：1、50：1)混合培養(yǎng)后應(yīng)用MT

4、T法測定各反應(yīng)孔的吸光值，通過公式計算出3組CTL對腎癌細胞的殺傷率。 結(jié)果：⑴聯(lián)合應(yīng)用GM—CSF、IL—4、TNF-α和腫瘤抗原可以誘導(dǎo)DC成熟，光鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，加入TNF-α和腫瘤抗原后DC體積變大，表面粗糙，突起更加明顯，呈典型的樹突狀，具有成熟DC的特征。⑵培養(yǎng)第7—8天時應(yīng)用FCM分析DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86的陽性表達率，結(jié)果顯示，HSAg—DC組的陽性表達率均高于Ag—DC組，其中

5、CD1a、CD83、CD86的表達差異有顯著性意義(P<0.05)。⑶各組DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL均對腎癌細胞產(chǎn)生殺傷作用，各組殺傷率隨效靶比的增高而增強；同一效靶比時HSAg—DC—CTL組殺傷效應(yīng)最強，Ag—DC—CTL組次之，non—DC—CTL組最弱，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組間殺傷率的差異均有顯著性意義(P<0.05)。 結(jié)論：①光鏡、電鏡觀察及FCM分析結(jié)果表明聯(lián)合應(yīng)用TNF-α和腎癌抗原可誘導(dǎo)DC成熟。②DC表面標志檢測結(jié)果提