肝癌細胞系HepG2特異性結合短肽的篩選及其特異性研究.pdf

1、肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程非常復雜，涉及到肝癌細胞多分子的調變，利用不同的新技術和新方法或者將其排列組合，對肝癌細胞或肝癌組織進行鑒定篩選，在肝癌診療研究中具有重要的意義。表面展示技術(surface display)在篩選新配體方面顯示了潛在的應用價值。本課題應用FliTrxTM細菌表面展示的隨機十二肽庫(FliTrxTM random peptide library)，通過活細胞篩選獲得能與人肝細胞肝癌細胞系HepG2特異性結合的多肽，為

2、肝癌的靶向診斷和靶向治療研究奠定實驗基礎。
　　 目的：
　　 從FliTrxTM細菌表面展示的隨機十二肽庫中篩選與人肝癌細胞系HepG2特異性結合的十二肽，鑒定其結合特性，利用生物信息學工具分析其結構，為尋找肝癌細胞表面特異性標志以及肝癌的靶向診斷與靶向治療研究奠定基礎。
　　 方法：
　　 1．肽庫的篩選以正常肝細胞系L02為減差篩選的對照細胞，肝癌細胞系HepG2為篩選的靶細胞，從FliTrxTM細

3、菌表面展示的隨機十二肽庫中篩選與HepG2特異性結合的短肽。經過五輪減差篩選，從最后一輪洗脫重收獲的細菌中隨機挑選700個單克隆細菌，通過菌落PCR篩選其中含有完整融合基因的克隆。
　　 2．短肽的特異性鑒定與序列分析以L02細胞為對照，通過流式細胞術(FCM)檢測單克隆和 HepG2的結合特異性；陽性克隆的測序結果與蛋白數據庫進行比對和同源性分析。進一步采用FCM鑒定單克隆十二肽與不同惡性腫瘤細胞系的結合特性，包括胃癌細胞系M

4、KN28、乳腺癌細胞系MCF7、宮頸鱗狀細胞癌細胞系Hela、早幼粒急性白血病細胞系HL60、慢性骨髓性白血病細胞系K562、肺鱗狀上皮細胞癌SLC等。
　　 3．結構預測
　　 利用Swissprot蛋白數據庫的ProtParam工具，初步分析特異性多肽的氨基酸序列及穩(wěn)定性；利用EMBL蛋白數據庫的AGADIR工具，預測其可能的二級結構；利用Swissprot蛋白數據庫的3Djigsaw蛋白質三級結構預測服務器模建短肽

5、-TrxA融合蛋白的空間構象。
　　 4．結合的靶分子分析利用SDS-PAGE優(yōu)化誘導細菌表達多肽的條件，進一步在Western-Blot中用可溶性短肽-TrxA融合蛋白檢測多肽與肝癌細胞膜蛋白的結合，以L02和SLC細胞為對照，分析多肽特異性識別的肝癌細胞表面分子。
　　 結果：
　　 1．肽庫的篩選以正常肝細胞系L02和肝癌細胞系HepG2為篩選靶細胞，對FliTrxTM細菌肽庫進行五輪差異篩選，從最后一輪篩

6、選得到的多克隆中隨機挑選700個陽性單克隆，菌落PCR結果表明，其中200個克隆含有完整的融合蛋白基因。
　　 2．短肽與肝癌細胞系結合的特異性FCM證實200個克隆中10個克隆表達的短肽可與肝癌細胞系HepG2相對特異性結合；經DNA測序，基因序列分析，確定7個陽性克隆，分別插入不同序列的隨機肽片段。7個短肽的基因序列中存在出現頻率較高的位點，但與Pubmed，Swissprot和EMBL的蛋白數據庫進行比對和同源性分析，并未

7、發(fā)現具有高度同源性的序列。
　　 FCM檢測7個短肽與不同惡性腫瘤細胞系(包括胃癌、乳腺癌、宮頸鱗狀細胞癌、早幼粒急性白血病細胞系、慢性骨髓性白血病細胞系、肺鱗狀上皮細胞癌)結合的特性，發(fā)現其中三個短肽只顯示出與肝癌細胞系相對較高的結合能力，命名為Hep1，Hep2和Hep3。
　　 3．結構分析預測結果利用ProtParam工具分析發(fā)現，Hep1和Hep2的結構相對不穩(wěn)定，而Hep3具有相對穩(wěn)定的線性結構。AGADIR

8、工具對二級結構的預測提示，Hep1和Hep2可能形成α螺旋，而Hep3不會形成α螺旋。3Djigsaw同源模建得到的三級結構提示短肽-TrxA融合蛋白中的短肽均形成突出于融合蛋白之外的空間構象，提示由TrxA形成的隨機肽的環(huán)狀結構在與靶分子的識別中起到了重要的作用。
　　 4．十二肽結合的靶分子利用可溶性Hep1，Hep2和Hep3與TrxA的融合蛋白檢測肝癌細胞，以SLC和L02細胞作為對照細胞，隨機挑取的無關單克隆短肽-Tr

9、xA融合蛋白作為對照檢測分子，Western-Blot結果顯示Hep1，Hep2和Hep3三種不同的短肽-TrxA融合蛋白均可以識別HepG2細胞膜蛋白中大小約為140kDa的分子片段，而與SLC和L02反應未見特異性條帶。隨機可溶性短肽-TrxA融合蛋白與肝癌細胞、SLC和L02細胞反應均為陰性。
　　 結論：以人肝細胞系L02為對照，人肝癌細胞系HepG2為靶細胞，通過五輪減差篩選，從細菌鞭毛展示的隨機肽庫中獲得與HepG2