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1、本文研究目的:通過(guò)在體外建立EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系,探索是否5-azacytidine可以使Cp去甲基化進(jìn)一步探索用siRNA抑制DNA甲基化酶的表達(dá)使EBV Cp激活而對(duì)EBV相關(guān)胃癌的治療有所幫助。 研究材料和方法: 一、細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞,生長(zhǎng)于10%的胎牛血清和10U/ml青霉素的Ham F-12培養(yǎng)液中,NUGC3細(xì)胞生長(zhǎng)于10%的胎牛血清和10U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%
2、CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。EBV陽(yáng)性.AGS/xneo細(xì)胞克隆和NUGC3/EBV生長(zhǎng)于10%的胎牛血清和10U/ml青霉素,G418 500ug/ml的Ham F-12或DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。Akata/xneo是EBV陽(yáng)性Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系<'[18]>,生長(zhǎng)于10%的胎牛血清和10U/ml青霉素,G418 700ug/ml的RPMI1640培養(yǎng)液中。P3HR1,MutuⅢ
3、,Daudi均生長(zhǎng)于10%的胎牛血清和10U/ml青霉素的RPMll640培養(yǎng)液中。 二、EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系的建立 采用cell to cell感染法。將用0.5%anti-human IgG誘導(dǎo)裂解感染的Akata細(xì)胞加入24小時(shí)前傳代的胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS或NUGC3的培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。反復(fù)清洗去除殘存的Akata細(xì)胞。1000細(xì)胞/孔鋪至96孔板,G418 500ug/ml選擇篩選EBV陽(yáng)性克隆。
4、三、免疫熒光染色法檢測(cè) 一定濃度的細(xì)胞抹片后晾干。檢測(cè)EBV EBNA時(shí)用丙酮:甲醇=1∶1混合液-20℃固定3分鐘。一抗用人血清37℃反應(yīng)40分鐘,PBS洗片5分,風(fēng)干后,二抗用FITC標(biāo)識(shí)的抗人C3C補(bǔ)體37%反應(yīng)20分鐘,PBS洗片10分鐘,風(fēng)干后熒光顯微鏡下觀察。 四、蛋白檢測(cè) western blot按常規(guī)方法操作,樣品為全細(xì)胞超聲裂解產(chǎn)物,4×10<'5>細(xì)胞裂解液上樣8%分離膠SDS-PAGE蛋白電
5、泳,電轉(zhuǎn)硝酸纖維膜(PVDF)膜,行Western blot,即轉(zhuǎn)膜成功后5%脫脂奶粉封閉,TBST洗膜后,加人血清一抗,4℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜;加鼠抗人1∶2000 HRP標(biāo)記二抗,室溫孵育30分,TBST洗膜,混合化學(xué)發(fā)光試劑1和試劑2加至膜上lmin,最后X片顯影。相應(yīng)抗體見(jiàn)附錄2。 五、RNA檢測(cè) RT-PCR及PCR Southern:細(xì)胞總RNA的提取按Trizol一步法RNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RNA的提
6、取:5-10×10<'6>細(xì)胞加入Trizol試劑1mL勻漿后置室溫5min,加入氯仿0.2mL,于4℃12000×g離心15min(離心后,混合物分成三部分-底層的酚-氯仿相、中間相和上層的元色水相。RNA在水相,DNA和蛋白質(zhì)在有機(jī)相及中間相),取上清,加異丙醇0.5mL15min后于4℃ 12000 × g離心15min,取沉淀溶于無(wú)RNA酶的去離子水中,用于RT-PCR擴(kuò)增。抽提出的RNA經(jīng)凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量,紫外分光光度計(jì)
7、260nm和280nm鑒定RNA的純度。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及電泳、結(jié)果判定。反應(yīng)體系為:RNA 2ug 6mer random primer 1ul用無(wú)RNAse水加至終體積5ul90℃ 10min立即放于冰上。5×緩沖液4μL,(10mM each)dNTP混合物1μL,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μL,25mmol MgSO<,4>5μL,用無(wú)RNAse水加至終體積20μL。37℃反轉(zhuǎn)錄60min。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,P
8、CR反應(yīng)體系為50μL,包括10×buffer 5μL,MgCl<,2> 1.5 mmol/L,dNTP 0.1 mmoL/L,上下游引物各0.5μmmol/L,Taq DNA聚合酶1.OU,cD-NA模板1 μL。參數(shù)設(shè)置如下94℃變性1 min,50℃退火45秒,72℃延伸1min,進(jìn)行30個(gè)周期的循環(huán)反應(yīng),最后72℃延伸5min。2%瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色)電泳100V 30min,紫外燈下觀察記錄照相。PCR-Southern
9、:用堿變性法將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)印至Hybond-N+尼龍膜(amersham pharmacia bio-tec,IRELAND)。用Gene Images 3-oligolabelling Module Kit(Amersham Bio-science RPN5770)標(biāo)記探針,嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行雜交,洗膜,最后用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)雜交信號(hào)。引物序列見(jiàn)附錄1。 六、質(zhì)粒的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 合成每條編碼shRNA的DNA模板的兩條單鏈,
10、退火DNA單鏈得到shRNA的DNA雙鏈模板。模板鏈后面接有RNA PolyⅢ聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn),同時(shí)兩端分別設(shè)計(jì)BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),可以克隆到siRNA載體多克隆位點(diǎn)的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間。PSilencer 2.1 hyg(AmbionInc)空載體用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳,回收線性載體。把退火的DNA模板雙鏈連接到線性載體中。采用T4連接酶,插入片斷與載體的摩爾比約為3∶1。連
11、接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,在LB Amp培養(yǎng)基上涂板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取轉(zhuǎn)化的菌落再進(jìn)行測(cè)序鑒定,確定shR-NA編碼框架和模板序列正確無(wú)誤。再將U6啟動(dòng)子和shRNA的DNA雙鏈模板片斷連接到Orip-SV-hyg載體上。ShRNA序列見(jiàn)附錄1。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:嚴(yán)格按照Lipofectamine<'TM> Reagent(Invitrogen 18324)說(shuō)明進(jìn)行操作。細(xì)胞接種到35 mm培養(yǎng)皿中,加入含10%胎牛血清的DME
12、M培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24 h。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)70%融合時(shí),棄去培養(yǎng)液,無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次,滴加含Lipofectamin(20μL)和質(zhì)粒DNA(2μg)的無(wú)血清培養(yǎng)基0.8 mL,輕輕混勻,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換普通培養(yǎng)液含150 mg/L的hygromycin培養(yǎng)液篩選。48小時(shí)后檢測(cè)。 研究結(jié)果: 一、建立的EBV陽(yáng)性胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS/EBV和NUGC
13、3/EBV體外培養(yǎng)呈Ⅰ型潛伏感染:體外感染后篩選的細(xì)胞克隆為EBV陽(yáng)性,EBNA免疫熒光染色見(jiàn)圖1。EBV相關(guān)蛋白的免疫印記(見(jiàn)圖2)顯示核蛋白除EBNA1陽(yáng)性外EBNA2 EBNA3s均為陰性。膜蛋白LMP1也為陰性。RT-PCR檢測(cè)不被翻譯成蛋白的小RNA(EBERs)為陽(yáng)性(見(jiàn)圖3)。而EBV體外轉(zhuǎn)化的LCL則均為陽(yáng)性,表現(xiàn)Ⅲ型隱形感染。在此作為陽(yáng)性對(duì)照,而EBV陰性細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 二、5-azacycidine可以活
14、化AGS/EBV和NUGC3/EBV內(nèi)EBNA Cp(C啟動(dòng)子)并呈計(jì)量依存性。RT-PCR法檢測(cè)AGS/xneo和NUGC3/EBV中EBV EBNA啟動(dòng)子顯示Cp Wp均呈不活化狀態(tài),Qp為活化狀態(tài)(見(jiàn)圖4)。以相應(yīng)濃度5-azacycidine處理5天后用RT-PCR及PCR-southern檢測(cè)啟動(dòng)子,結(jié)果顯示Cp呈計(jì)量依賴性活化(見(jiàn)圖5,6)。Wp Qp無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖7)。 三、5-azacycidine處理后伴隨著
15、Cp活化,可見(jiàn)LMP1呈計(jì)量依賴性表達(dá)(見(jiàn)圖8)。 四、5-azacycidine處理后用western blot檢測(cè)DNA甲基化酶,結(jié)果顯示DNA甲基化酶1(DNMT1)被明顯抑制(見(jiàn)圖9)。 五、用RT-PCR檢測(cè)EBV潛伏感染Ⅰ型和Ⅲ型Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系DNA甲基化酶的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示Ⅰ型細(xì)胞中DNA甲基化酶1(DNMT1)和DNA甲基化酶3b(DNMT3b)的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于Ⅲ型潛伏感染細(xì)胞(見(jiàn)圖10)
16、。 六、用干涉RNA(siRNA)抑制DNA甲基化酶1(DNMT1)不能活化Cp。用Lipofectamin和DNMT1 shRNA的DNA雙鏈模板片斷Orip-EBNA1載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可見(jiàn)DNMT1的表達(dá)被明顯抑制。Western blot檢測(cè)DNMT1結(jié)果見(jiàn)圖11。但Cp無(wú)明顯活化。RT-PCR結(jié)果見(jiàn)圖12。 七、干涉RNA(siRNA)抑制DNA甲基化酶1(DNMT1)和抑制DNA甲基化酶3b(DNMT3b)不能明
17、顯活化Cp。 采用干涉RNA(siRNA)抑制DNA甲基化酶1和3b(DNMT3b)不能明顯活化Cp。用Lipofectamin和DNMT1 shRNA的DNA雙鏈模板片斷Orip-EBNA1載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可見(jiàn)DNMT3b的表達(dá)被抑制。而DNMT1表達(dá)則增強(qiáng)。相反也可見(jiàn)在DNMT1被抑制時(shí)DNMT3b有所增強(qiáng)。Western blot檢測(cè)DNMT1及3b結(jié)果見(jiàn)圖13。用RNA干涉法同時(shí)抑制DNMTl和3b時(shí)Cp有少許活化。RT-
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