SCIN促進胃癌細胞侵襲機制及胃腸道間質瘤細胞系的建立.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 SCIN促進胃癌細胞侵襲機制研究
　　目的:
　　胃癌在全世界范圍內，其發(fā)病率排在所有腫瘤的第四位，而死亡率則位居所有腫瘤相關死亡原因的第二位。盡管由于近年來手術技術的發(fā)展、放化療的應用以及早期診斷的增多，胃癌的死亡率有所下降，但是進展期胃癌患者的生存率仍然很低。許多胃癌患者在經過根治手術以及化療后，仍然會有復發(fā)及轉移，而在胃癌發(fā)生復發(fā)或轉移后，其治療更加困難，手術難度加大

2、。而胃癌細胞的侵襲轉移是目前對其治療的最大難關，目前對胃癌侵襲轉移的具體分子機制仍然不甚明了，故闡明胃癌細胞侵襲轉移的具體分子機制對胃癌的治療意義重大。
　　課題組前期研究已經表明，SCIN在胃癌組織中存在表達，且表達明顯高于癌旁組織，SCIN的表達與患者預后存在明顯相關性，SCIN高表達的胃癌患者預后明顯差于低表達者，SCIN還具有促進胃癌細胞侵襲轉移和成瘤的能力，但是其中的具體分子機制和通路仍然未知。
　　本研究旨在闡明

3、SCIN促進胃癌細胞侵襲和轉移能力的具體機制，并探討SCIN作為胃癌預后指標及成為治療靶點的可能性。
　　方法:
　　1.通過免疫熒光染色的方法來觀察在敲低SCIN后，胃癌細胞系MGC803和原代胃癌細胞XN0422的偽足形成能力的變化情況。
　　2.通過qRT-PCR檢測敲低SCIN后胃癌細胞系MGC803和原代胃癌細胞XN0422中Cdc42分子RNA表達的改變。
　　3.通過Western blotting

4、檢測在敲低SCIN后，胃癌細胞系MGC803和胃癌原代細胞XN0422中Cdc42分子蛋白表達的改變。
　　結果:
　　1.免疫熒光染色發(fā)現，在胃癌細胞系MGC803和原代胃癌細胞XN0422中敲低SCIN后，兩種細胞均能觀察到敲低組細胞的偽足數量較對照組明顯減少。
　　2.通過qRT-PCR檢測胃癌細胞系MGC803和原代胃癌細胞XN0422中敲低SCIN后，兩種細胞的敲低組Cdc42的RNA表達減少，且較對照組減少

5、約50％。
　　3.通過Western blotting檢測胃癌細胞系MGC803和原代胃癌細胞XN0422中敲低SCIN后，兩種細胞的敲低組Cdc42的蛋白表達均較對照組減少，而蛋白表達減少量較RNA表達減少量更加明顯。
　　結論:
　　1.偽足形成能力的改變參與了SCIN促進胃癌細胞的侵襲轉移過程。
　　2.敲低SCIN可以降低胃癌細胞中Cdc42的RNA和蛋白質表達量，說明SCIN對偽足形成的調控作用是通過

6、對Cdc42的調控而實現。
　　第二部分 胃腸道間質瘤細胞系的建立及特性鑒定
　　目的:
　　胃腸道間質瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GIST)是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，起源于胃腸道間質的Cajar細胞，其發(fā)病率約為每年10～20/10萬。胃腸道間質瘤主要發(fā)生于胃(50％～70％)，其次為小腸(20％～30％)，其他發(fā)病部位可包括食管，結直腸甚至消化道外的其他部位（小于10％）。

7、目前原發(fā)性胃腸道間質瘤的主要治療方法是手術切除并配合術后伊馬替尼進行靶向治療。
　　c-kit基因(75％-85％)或者PDGFRA基因(platelet-derived growth factor receptoralpha;5％-7％)發(fā)生功能獲得性突變是大多數胃腸道間質瘤發(fā)病的始動因素，進而使酪氨酸激酶持續(xù)激活，并獲得不受機體調控的增殖能力。因此胃腸道間質瘤是可以通過酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼類藥物進行治療的。然而伊馬替尼也無

8、法治愈此病，耐藥后的復發(fā)是最主要因素，有多達50％的患者會發(fā)生耐藥進而腫瘤復發(fā)，而發(fā)生耐藥及復發(fā)的時間往往在中位治療期2年內。
　　盡管目前對伊馬替尼耐藥的部分機制有所了解，但是對其深層的分子機制仍然知之甚少。而當前對胃腸道間質瘤的研究因為缺乏合適的及容易獲取的細胞系而受到限制。據我們所知，目前有公開報道的胃腸道間質瘤細胞系并不多，僅包括GIST-T1、GIST-H1以及GK1C和GK3C。
　　研究旨在建立一株胃腸道間質瘤

9、細胞系，并對其進行相對完整的特性鑒定以使其可以廣泛應用于胃腸道間質瘤的研究。
　　方法:
　　1.通過組織塊法對腫瘤組織進行原代細胞培養(yǎng)，在腫瘤細胞爬出后通過局部傳代的方式富集腫瘤細胞，而后通過凍存、復蘇和傳代以淘汰成纖維細胞并獲得穩(wěn)定的胃腸道間質瘤細胞系。
　　2.通過免疫組織化學染色的方法檢測患者腫瘤組織以及移植瘤中的CD117，CD34，DOG-1，α-SMA，S-100的表達。
　　3.通過免疫熒光染色的

10、方法檢測細胞中CD117分子的表達情況。
　　4.通過免疫細胞化學染色方法，檢測細胞中CD117，CD34，DOG-1，α-SMA，及S-100的表達。
　　5.通過繪制生長曲線并計算倍增周期的方法以獲得其增殖能力特性。通過透射電鏡觀察細胞微結構，通過核型鑒定分析染色體變異情況。
　　6.通過裸鼠皮下移植瘤形成實驗驗證其成瘤能力。將裸鼠按照接種細胞數目分為4組:1×104組，1×105組，5×105組，1×106組。每

11、組4只裸鼠，每只裸鼠接種一個位點。
　　7.通過伊馬替尼藥物殺傷實驗明確其對伊馬替尼的敏感性，并計算出伊馬替尼對其作用的IC50（half maximal inhibitory concentration，半抑制濃度）。
　　8.通過對c-kit基因的第8、9、11、13、17外顯子及PDGFRA基因的第12、14、18外顯子測序，以明確其是否發(fā)生突變以及發(fā)生突變的位點及意義。
　　9.所有實驗至少重復3次，實驗結果表

12、述為平均值±標準差。數據分析使用SPSS17.0統計分析軟件，兩組間的比較采用t檢驗，移植瘤重量的比較采用非參數檢驗，伊馬替尼IC50的計算采用曲線擬合分析。
　　結果:
　　1.通過組織塊法，成功分離并培養(yǎng)出胃腸道間質瘤的腫瘤細胞，而后通過傳代，凍存和復蘇逐步淘汰掉其中的成纖維細胞，并使其適應體外生長環(huán)境，表現出穩(wěn)定的細胞形態(tài)及特性。
　　2.對患者腫瘤組織以及裸鼠移植瘤的免疫組織化學染色分析發(fā)現，CD117(+)、

13、CD34(+)、 DOG-1(+)、α-SMA(-)、 S100(-)。
　　3.免疫熒光檢測細胞中CD117的表達，結果表明CD117在此細胞中存在表達，表達主要位于細胞膜。
　　4.通過免疫細胞化學染色的方法檢測細胞中的分子表達，結果發(fā)現CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、α-SMA(-)、S100(-)，同患者腫瘤組織及移植瘤檢測的結果相同。
　　5.根據實驗結果繪制生長曲線，并計算得其倍增周期為

14、24.063h。透射電鏡觀察細胞微結構，結果顯示其細胞核明顯增大，核質比增高，核膜清晰，核仁大，可有單個或雙個，核形態(tài)不規(guī)則，細胞微絨毛減少或消失。通過核型鑒定檢測其染色體變異情況，結果發(fā)現其染色體為亞三倍體核型的組合核型，染色體數目約為64～68條。存在涉及到Y、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、21、22等多條染色體參與的復雜數目及結構異常，包括易位、缺失、重復等。
　　6.此細胞系具

15、有高效的成瘤能力。移植瘤實驗發(fā)現1×106組最早于接種第7天出現肉眼可見腫瘤，而1×104組最早于第13天出現肉眼可見腫瘤，3周后所有接種位點均有肉眼可見腫瘤形成，此時收割腫瘤。重量統計結果顯示移植瘤重量與接種細胞數目正相關，且各組形成移植瘤的重量具有統計學差異(P＜0.05)。
　　7.使用伊馬替尼檢測其藥物敏感性并計算出IC50值，結果表明此細胞對伊馬替尼許多敏感，IC50=0.5343μmol/L。
　　8.使用外顯子

16、測序技術檢測了c-kit基因的8、9、11、13、17號外顯子以及PDGFRA基因的12、14、18號外顯子。結果顯示c-kit基因的五個外顯子及PDGFRA基因的14號外顯子未發(fā)生突變，而PDGFRA基因的12號外顯子于1701位點發(fā)生突變，A＞G;18號外顯子的2472位點C＞T。二者均為同義突變，不影響氨基酸編碼。
　　結論:
　　1.成功從患者腫瘤組織中分離培養(yǎng)出一例胃腸道間質瘤細胞系。
　　2.此細胞系分子表