樹突狀細(xì)胞—腎癌786-O細(xì)胞株融合瘤苗的制備及其體外抗腎癌效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：制備和篩選純凈的樹突狀細(xì)胞(DC)-腎癌786-O細(xì)胞株融合瘤苗，探索融合瘤苗的生物學(xué)特性及體外抗腎癌效應(yīng)，為基于DC的腎癌免疫治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1、樹突狀細(xì)胞-腎癌786-O細(xì)胞株融合瘤苗制備及形態(tài)學(xué)觀察。密度梯度離心從健康人外周血分離單個(gè)核細(xì)胞，聯(lián)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)7-9天即為成熟DC，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子表達(dá)。將凍存的腎癌786-O細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng)，與成

2、熟DC按5:1比例混合，用聚乙二醇(PEG)作融合劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合。加入與DC體外誘導(dǎo)時(shí)相同濃度的細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4靜置培養(yǎng)，24h后棄去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，4d后收集懸浮和半懸浮融合細(xì)胞。分別在光鏡和電鏡下觀察融合細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。2、融合瘤苗生物學(xué)特性及體外抗腎癌786-O細(xì)胞免疫特性。體外培養(yǎng)融合瘤苗并計(jì)數(shù)，描繪細(xì)胞體外生長曲線，比較融合細(xì)胞和親代細(xì)胞體外培養(yǎng)分裂增殖的能力；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測比較

3、DC-RCC786-O融合瘤苗、單純培養(yǎng)的DC、與腎癌786-O混合培養(yǎng)相同天數(shù)的DC三組細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測融合瘤苗細(xì)胞表面分子CD86,HLA-DR的表達(dá)，與單純培養(yǎng)DC表面分子的表達(dá)水平比較；聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠背部皮下注射融合瘤苗，檢測融合瘤苗體內(nèi)應(yīng)用的安全性；MTT比色法檢測比較DC-RCC786-O融合瘤苗、單純培養(yǎng)DC、與腎癌786-O混合培養(yǎng)DC三組細(xì)胞分別誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(

4、CTL)體外殺傷腎癌靶細(xì)胞的能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測融合瘤苗對殺傷后腎癌786-O靶細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果：1、患者外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后可獲得形態(tài)典型的樹突狀細(xì)胞，成熟DC表達(dá)表面分子CD86，HLA-DR分別為(62.07±2.01)％和(66.30±1.51)％；PEG可有效促使DC與腎癌786-O細(xì)胞株融合；用兩次貼壁法可分選出較純的DC-786-O融合瘤苗；融合瘤苗較親代細(xì)胞體積明顯增大，在培養(yǎng)基中懸浮生長。2、

5、融合瘤苗體外生長曲線平緩，無明顯細(xì)胞倍增期；融合瘤苗在SOD鼠體內(nèi)注射不生成腫瘤；瘤苗表面共刺激分子CD86，HLA-DR的表達(dá)率分別為(81.23±1.01)％和(80.16±1.11)％，明顯高于單純DC表達(dá)水平(P＜0.05)；融合瘤苗刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于親代DC和與786-O混合培養(yǎng)的DC，差異均具有顯著性(P＜0.05)；融合瘤苗與T細(xì)胞在效靶比為1:1時(shí)刺激T細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)；MTT比色檢測，融合瘤苗組對腎癌靶細(xì)胞

6、的殺傷率為(75.49±5.10)％，與混合培養(yǎng)DC組殺傷率(45.44+2.87)％和單純T淋巴細(xì)胞對照組殺傷率(14.55±0.75)％相比差異均具有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論：1、外周血單核細(xì)胞經(jīng)rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α等細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)分化可獲得具有典型形態(tài)和細(xì)胞表型的成熟DC；DC與786-O細(xì)胞株經(jīng)PEG誘導(dǎo)融合和兩次貼壁分選純化后可獲得較為純凈的融合瘤苗。2、融合瘤苗體外懸浮生長，分裂增殖