小鼠樹突狀細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效應(yīng)研究.pdf

1、目前腫瘤治療方法主要有手術(shù)、化療、放療和生物治療。其中腫瘤生物治療是目前研究的熱點，具有良好的前景，樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是腫瘤生物治療的重點研究對象。樹突狀細(xì)胞是目前己知功能最強的抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell，APC)，其在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。本課題將DC與腫瘤細(xì)胞融合制成瘤苗，使該融合細(xì)胞即表達(dá)腫瘤抗原又具有提呈抗原的能力。
　　Exosomes為一種直徑30-12

2、0nm大小的囊泡狀物質(zhì)，其中含有核酸和蛋白質(zhì)。多種細(xì)胞已經(jīng)被證實在體外都能向細(xì)胞外釋放exosomes，包括:多種血細(xì)胞（B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞，血小板）、腸上皮細(xì)胞、施萬細(xì)胞（schwann，又名雪旺細(xì)胞）、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞系[37-41]。目前在臨床和實驗研究中具有抗腫瘤作用的exosomes主要有兩種，一是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的exosomes(Tumor Derived Exosomes，TEX

3、)，因其含有許多腫瘤細(xì)胞所共有的腫瘤抗原，具有潛在的加強腫瘤細(xì)胞免疫原性、促進抗腫瘤免疫的作用[42];二是DCs來源的exosomes(Dendritic Cells Derived Exosomes，DEX)。也有研究表明，某些腫瘤細(xì)胞和不成熟樹突狀細(xì)胞來源的exosomes不能有效增強機體免疫，甚至具有免疫耐受作用。因此，exosomes是否具有抗腫瘤免疫效應(yīng)，不僅與其來源細(xì)胞的特點和功能狀態(tài)有關(guān)，也需要對獲得的exosomes進

4、行體內(nèi)外試驗進行功能驗證。
　　考慮到DC細(xì)胞的抗原提呈能力和腫瘤細(xì)胞易增殖的特點，有研究者采用雜交瘤技術(shù)將DC與骨髓瘤細(xì)胞融合制成瘤苗，即克服了DC細(xì)胞分離提取和培養(yǎng)困難的問題，也克服了腫瘤細(xì)胞免疫原性弱、抗原提呈能力差的弱點，在體內(nèi)外研究上都顯示出了抗腫瘤效應(yīng)。但該融合細(xì)胞分泌exosomes是否具有融合細(xì)胞膜標(biāo)志的特點、是否具有抗腫瘤作用，報道尚少。本文將骨髓瘤細(xì)胞和DC融合，再提取融合細(xì)胞分泌的exosomes，進行抗腫瘤

5、效應(yīng)研究。
　　目的:
　　為獲得理化性質(zhì)穩(wěn)定、耐高溫、制備時可質(zhì)控，較細(xì)胞性瘤苗更具優(yōu)越性的腫瘤治療疫苗，本文通過收集DC/腫瘤細(xì)胞融合細(xì)胞上清液，分離提取exosomes，并對其進行鑒定和抗腫瘤效應(yīng)研究，以期為DC/腫瘤細(xì)胞融合疫苗的應(yīng)用開辟新的途徑。
　　方法:
　　1.DC的提取和培養(yǎng):取6-8周BALB/c雄性小鼠，無菌分離股骨、脛骨和腓骨，髓腔沖洗獲得骨髓細(xì)胞，靜置24h，去除未貼壁細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞培

6、養(yǎng)于含10％胎牛血清DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液中，加入粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor，GM-CSF)20ng/ml，白細(xì)胞介素-4（Interleukin4，IL-4）10ng/ml，誘導(dǎo)其向DC分化。
　　2.骨髓瘤sp2/0細(xì)胞培養(yǎng):從液氮中取出細(xì)胞株，復(fù)蘇后在含10％胎牛血清D

7、MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，融合前用8-氮鳥嘌呤（8-Azaguanine，8-AG）處理兩周。
　　3.DC與sp2/0細(xì)胞融合及鑒定:使用聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)化學(xué)融合法與電融合法相結(jié)合的方法制備DC/sp2/0融合細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析融合效率，激光共聚焦鑒定融合細(xì)胞。
　　4.DC/sp2/0融合細(xì)胞的培養(yǎng):融合后將細(xì)胞移入96孔板，使用含1％HAT（H-Hypoxanthine次黃嘌呤，A

8、-Aminopterin甲氨喋呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷）的10％胎牛血清DMEM選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，改用含1％HT（H-Hypoxanthine次黃嘌呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷）的10％胎牛血清DMEM選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，再改用正常10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)期間加入GM-CSF100ng/ml。
　　5.Exosomes的提取及鑒定:收集經(jīng)篩選后的融合細(xì)胞上清，采用密度梯度離心法[15]，提

9、取上清液中exosomes，運用紫外分光光度儀對exosomes進行定量，用投射電鏡觀察exosomes形態(tài)，運用SDS-PAGE和western blot對exosomes進行鑒定。
　　6.T淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng):自6-8周BALB/c雄性小鼠脾臟中分離單個核細(xì)胞，尼龍毛吸附法獲得T細(xì)胞，含IL-2(30μg/ml)的10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
　　7.T淋巴細(xì)胞增殖實驗:在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入exosome

10、s，并用MTT比色法檢測T細(xì)胞增殖。
　　8.DCex、imDCex及融合細(xì)胞Exosomes對T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的影響:將T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入DCex、imDCex和exosomes，6天后取三組T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，進行CTL殺傷試驗。設(shè)單獨T細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞為對照。使用MTT比色法檢測T細(xì)胞靶細(xì)胞殺傷能力。
　　9.實驗結(jié)果用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0分析。
　　結(jié)果:
　　1.DC與sp2/0細(xì)胞

11、融合及鑒定:小鼠骨髓貼壁細(xì)胞經(jīng)GM-CSF、IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)7d，呈現(xiàn)典型形態(tài)特征的DCs;與骨髓瘤細(xì)胞融合效率經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測為45％左右，激光共聚焦顯微鏡下見到了雙陽性的融合細(xì)胞。
　　2.DC/sp2/0融合細(xì)胞分泌exosomes的提取和鑒定:融合細(xì)胞呈貼壁生長，類圓形，收集上清提取exosomes經(jīng)western blot鑒定顯示，融合細(xì)胞分泌的exosomes攜帶有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子。對照組sp2/0細(xì)胞分

12、泌的exosomes不帶有MHC-Ⅱ分子。
　　3.T淋巴細(xì)胞增殖實驗:融合細(xì)胞分泌的exosomes和成熟DCs來源的exosomes有顯著促進T細(xì)胞增殖的作用，且與exosomes的劑量呈正相關(guān)，與對照組相比P＜0.01。未成熟DC分泌的exosomes不具有促進T細(xì)胞增殖的能力，與對照組相比，無顯著差異，P＞0.05。
　　4.CTL實驗:融合細(xì)胞分泌的exosomes和成熟DC來源的exosomes能誘導(dǎo)出CTL殺傷