WGP通過上調(diào)樹突狀細胞GITRL的表達增強Lewis肺癌移植瘤小鼠抗瘤免疫應答.pdf

1、目的:利用釀酒酵母來源的β-葡聚糖——WGP(wholeβ-glucanparticles)結合樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)表面Dectin(DC-associated C-type lectin)-1受體,檢測相關胞內(nèi)信號分子的改變,并觀察DC表面糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體家族相關配體(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand,GITRL)的表達

2、情況；利用小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,觀察WGP對腫瘤生長的影響,并研究WGP調(diào)節(jié)荷瘤小鼠抗瘤免疫應答的新機制。
　　 方法:
　　 1.通過GM-CSF和IL-4培養(yǎng)體系,體外誘導小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDC),采用流式細胞術(FCM)檢測其純度。
　　 2.通過PCR和流式細胞術檢測D2SC／1細胞系以及BMDC細胞Dectin-1的表達情況。
　　 3.體外采用WGP刺激D2SC／1細胞系和

3、BMDC,通過Western-blot方法檢測Dectin-1下游信號分子的活化情況；利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和流式細胞術檢測細胞mGITRL的表達情況。
　　 4.體外將WGP刺激后的D2SC／1細胞或BMDC與調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)抑制體系或單獨的效應性T細胞(Teff)共培養(yǎng),采用[3H]TdR摻入試驗檢測WGP刺激后的DC對Treg的抑制功能和對效應性T細胞增殖的影響。
　　 5.利用小鼠Lew

4、is肺癌移植瘤模型,觀察經(jīng)WGP處理后腫瘤的發(fā)展進程,采用流式細胞術和qRT-PCR檢測小鼠體內(nèi)DC細胞mGITRL的表達、CD3+CD8+IFNγ+T細胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的變化情況。并通過GITR蛋白阻斷WGP處理后荷瘤小鼠表達上調(diào)的mGITRL,觀察腫瘤的生長、CD3+CD8+IFNγ+T細胞及CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的變化情況。
　　 結果:
　　 1.體外成功誘導和培

5、養(yǎng)BMDC,經(jīng)檢測其純度>90％。
　　 2.經(jīng)PCR和流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)D2SC／1細胞系以及BMDC細胞均有Dectin-1受體的表達。
　　 3.通過Western-blot檢測,發(fā)現(xiàn)經(jīng)WGP刺激后D2SC／1細胞和BMDC細胞Dectin-1下游信號分子Syk磷酸化水平明顯升高；qRT-PCR和流式細胞術結果均顯示:經(jīng)WGP刺激后D2SC／1細胞和BMDC細胞mGITRL的表達均上調(diào),并具有濃度依賴性。
　

6、　 4.體外增殖試驗及Treg細胞免疫抑制功能試驗表明,WGP刺激DC后表面上調(diào)的mGITRL能夠通過GITR／GITRL系統(tǒng)促進效應性T細胞增殖,下調(diào)Treg細胞的抑制功能。
　　 5.WGP能夠有效地延緩Lewis肺癌移植瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的發(fā)展進程,抑制腫瘤的生長。FCM及qRT-PCR檢測結果顯示,經(jīng)WGP處理后,其局部引流淋巴結、腫瘤組織中DC的比例、數(shù)目及其mGITRL的表達明顯增加；脾臟、局部引流淋巴結、腫瘤組織浸潤

7、的CD3+CD8+IFNγ+T細胞的比例和數(shù)目明顯上升；腫瘤組織浸潤的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞比例明顯下降,而脾臟、局部引流淋巴結中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的比例和數(shù)目與對照組相比并無明顯變化,但是其免疫抑制功能明顯下調(diào)。
　　 為了阻斷WGP處理組荷瘤小鼠體內(nèi)表達上調(diào)的GITRL,我們體內(nèi)給予可溶性GITR蛋白。與單獨WGP處理的荷瘤小鼠相比,WGP+GITR組荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長明顯加快

8、,腫瘤大小及重量明顯增加；脾臟、局部引流淋巴結的CD3+CD8+IFNγ+T細胞的比例和數(shù)目明顯下降,而腫瘤局部浸潤的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞比例明顯上升。
　　 結論:
　　 1.體外實驗發(fā)現(xiàn)WGP可通過Dectin-1／Syk途徑活化DC,上調(diào)DC表面mGITRL的表達,且上調(diào)的mGITRL能夠促進效應性T細胞的增殖,同時下調(diào)Treg細胞的免疫抑制功能。
　　 2.WGP能夠明顯延緩腫瘤的發(fā)