小鼠樹突狀細胞TLR7表達及其介導的免疫應答初步研究.pdf

1、樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）作為體內功能最強的專職抗原提呈細胞，主要依賴其表面的Toll樣受體（Toll liker eceptors，TLRs）識別病原微生物，誘導固有免疫（innate immunity）應答，激活特異性免疫應答。Toll樣受體7（Toll like receptor 7，TLR7）是近年發(fā)現(xiàn)的一類特殊的TLRs，廣泛存在于體內免疫細胞中，尤以DC為著。業(yè)已證實，TLR7主要作為某些小分子抗病毒化

2、合物和病毒單鏈RNA(single strand RNA，ssRNA)分子的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR），介導DC發(fā)揮免疫應答效應。迄今為止，人們對TLR7的亞細胞定位及其識別配體后介導的免疫效應尚不完全清楚。因此，對TLR7的深入研究，將進一步揭示機體抗感染免疫的分子機制。
　　為了解DC中TLR7介導的免疫反應，本課題采用小鼠永生化的樹突狀細胞系DC2.4為細胞模型，檢測了

3、DC2.4中TLR7和TLR4的表達及TLR7識別配體Imiquimod后介導的DC免疫應答效應。
　　本課題的研究內容和實驗結果如下：
　　1.DC2.4中TLR7基因和蛋白表達檢測
　　根據Genebank中的小鼠TLR7和β-actin基因全序列，分別設計相應上、下游引物各一對，用反轉錄PCR（RT-PCR）檢測DC2.4中TLR7mRNA表達，Western blot檢測DC2.4中TLR7蛋白表達。結果顯示，

4、DC2.4中TLR7只有mRNA轉錄，檢測不到蛋白表達。
　　2.DC2.4中TLR4蛋白表達檢測
　　在放有蓋玻片的六孔板中，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)DC2.4，待蓋玻片上細胞長至約50～60％時，用間接免疫熒光法檢測DC2.4中TLR4蛋白表達。結果顯示，DC2.4細胞膜表面可檢測到TLR4蛋白表達。
　　3.TLR4的配體——LPS刺激DC2.4，誘導TLR7蛋白的表達
　　培養(yǎng)DC2

5、.4至對數(shù)生長期，培養(yǎng)液中加入LPS（1mg/L），分別在12h、24h、48h、72h收集細胞，提取蛋白，以未加入LPS組為陰性對照，胎盤組織提取蛋白為陽性對照，用Westernblot檢測蛋白表達情況。結果表明，LPS刺激DC2.4后12h，可檢測到TLR7蛋白的表達，但72h后未能檢測到。陰性對照組無TLR7蛋白表達，陽性對照組有明顯的TLR7蛋白表達。4.TLR7識別配體Imiquimod介導的DC免疫應答效應
　　將DC

6、2.4按1×108/L接種于96孔板，共分4組，每組均設復孔。設L0組為陰性對照組，L組加入LPS(1mg/L)，I組加入抗病毒化合物Imiquimod（10mol/L），LI組先加入LPS(1mg/L)，12h后加入Imiquimod（10mol/L）。培養(yǎng)12h后收獲各組細胞培養(yǎng)上清，離心后用ELISA方法檢測IL-12和IFN-α表達水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。數(shù)據采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計處理。結果顯示，Imiqu

7、imod刺激表達TLR7蛋白的DC2.4后，IL-12分泌顯著增加，IFN-α分泌無顯著變化。
　　結論：
　　1．在DC2.4中有TLR4蛋白和TLR7mRNA表達，但檢測不到TLR7蛋白表達。
　　2．TLR4天然配體LPS刺激12h后，可誘導DC2.4表達TLR7蛋白，但72h后未能檢測到蛋白表達。
　　3．在DC2.4中，誘導表達的TLR7蛋白分子可以識別配體Imiquimod，激活信號轉導途徑，介導DC