單核細(xì)胞TLR7和TLR8的表達(dá)及功能與HIV感染關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 近二十年來研究者們一直致力于獲得性免疫對(duì)HIV感染的免疫應(yīng)答研究,但到目前為止在免疫治療和疫苗方面尚無突破性進(jìn)展。近來研究顯示,在HIV感染中天然免疫系統(tǒng)可能占有非常重要的地位。天然免疫系統(tǒng)即是機(jī)體抵御外來病原微生物入侵的第一道防線,同時(shí)又在調(diào)節(jié)獲得性免疫中發(fā)揮著重要的作用,單核細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞,其表達(dá)具有高度同源性的Toll樣受體7和8(Toll-LikeReceptor7 and8,TLR7和8),

2、能夠識(shí)別病毒單鏈RNA(ssRNA),活化核因子NF-κB,促進(jìn)細(xì)胞因子IL-12p40、TNF-α等的分泌。最近研究發(fā)現(xiàn)TLR7和8能夠識(shí)別HIV-1長(zhǎng)末端重復(fù)序列(HIV-1 LTR)上富含尿嘧啶的ssRNA(ssRNA40)。單核細(xì)胞TLR7和8的表達(dá)是否與HIV感染的疾病進(jìn)程有關(guān),是否為HW感染者疾病進(jìn)展緩慢的保護(hù)因素,目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。TLR7和8的表達(dá)水平能否影響其介導(dǎo)的單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平,亦無文獻(xiàn)報(bào)道。TLR7和8

3、介導(dǎo)的NF-κB的活化能夠同時(shí)促進(jìn)Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,且在HIV-1 LTR上存在著NF-κB的結(jié)合位點(diǎn),能夠與NF-κB結(jié)合促進(jìn)HIV的復(fù)制,可見單核細(xì)胞TLR7和8活化能夠介導(dǎo)的雙重作用,那么它如何影響HIV的復(fù)制呢?目前尚無明確的結(jié)論。本文首次研究了不同疾病進(jìn)程的HIV感染者單核細(xì)胞的TLR7和8表達(dá)水平和其介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌功能以及對(duì)HIV復(fù)制的影響,初步探討了HIV感染者單核細(xì)胞TLR7和8表達(dá)及其介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)HIV感染

4、疾病進(jìn)程的影響及可能的致病機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、研究對(duì)象
　　 由遼寧省疾病預(yù)防與控制中心,河南省疾病預(yù)防與控制中心和中國(guó)醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)Western blot試驗(yàn)確認(rèn)為HIV陽性的HIV/AIDS患者。根據(jù)HIV/AIDS患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量和感染時(shí)間不同,分成三組:緩慢進(jìn)展組,CD4+T淋巴細(xì)胞≥500個(gè)/μl,感染HIV10年以上,未經(jīng)抗病毒治療,無艾滋病指征性癥狀;HI

5、V感染組,CD4+T淋巴細(xì)胞≥200個(gè)/μl,無艾滋病指征性疾病;AIDS病組,CD4+T淋巴細(xì)胞＜200個(gè)/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病。HIV抗體陰性的健康對(duì)照來自本院健康體檢門診的體檢者,血液系統(tǒng)及肝腎功能檢查結(jié)果正常,無免疫系統(tǒng)000疾病史。
　　 2、標(biāo)本采集
　　 用10毫升EDTA抗凝負(fù)壓真空采血管采集研究對(duì)象外周靜脈血,在6小時(shí)內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。
　　 3、T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和比值測(cè)定
　　 將20

6、μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,應(yīng)用反向加樣法加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min,FACSMULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析,計(jì)算CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。
　　 4、密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞
　　 離心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液14ml,沿管壁緩慢加入用PBS稀釋后的抗凝全血30ml,離心400g,

7、30min。用毛細(xì)管吸取界面層的PBMC,移入另一試管中。加入5倍體積的PBS緩沖液,洗細(xì)胞2次。
　　 5、CD14+單核細(xì)胞分選
　　 采用德國(guó)Miltenyi公司的MACS免疫磁珠分選裝置,嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。每10M細(xì)胞加20μl抗CD14免疫磁珠,4℃結(jié)合15min,300g離心10 min,500μl緩沖液重懸細(xì)胞,經(jīng)LS柱子進(jìn)行陽性分選。取少量細(xì)胞加入20μl CD3-FITC、20μl CD14-PE

8、及20μl CD4-PerCP,用流式細(xì)胞儀Cellquest軟件檢測(cè)分選細(xì)胞純度。
　　 6、單核細(xì)胞體外培養(yǎng)及刺激
　　 將分選的單核細(xì)胞用含有1％PS,2mmol/L的L-谷氨酰胺,25mmol/L HEPES緩沖液,10％胎牛血清的RPMI1640調(diào)整濃度為1×106/mL,培養(yǎng)于48孔板中,所用的培養(yǎng)基及材料均不含內(nèi)毒素。用2.5μg/ml的R848刺激單核細(xì)胞,于37℃5％的CO2孵箱中培養(yǎng),對(duì)照組加入同體積

9、的PBS,每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,24小時(shí)后收集上清和細(xì)胞.
　　 7、制備細(xì)胞RNA
　　 按照QIAGEN公司細(xì)胞RNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作,通過全自動(dòng)紫外分光光度儀檢測(cè)所得RNA的質(zhì)量和濃度。
　　 8、引物及探針的設(shè)計(jì)和合成
　　 上述引物經(jīng)BLAST分析,匹配率為100％。
　　 9、標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行,RT反應(yīng)體系為總RNA

10、500ng,隨機(jī)引物Oligo dT(50μM)0.5μl,Random6 mers(100μM)0.5μl,5×PrimeScriptBuffer2μl,PdmeScript RT Enzyme Mix I0.5μl,用Rnase Free dH2O補(bǔ)齊10μl。反應(yīng)條件為37℃15 min,85℃5see,4℃終止反應(yīng),所得cDNA-20℃凍存?zhèn)溆?。利用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增TLR7、TLR8和GAPDH,PCR產(chǎn)物膠回收純化

11、后克隆到pUCmT-vector,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌中,藍(lán)白篩選后獲得陽性克隆,測(cè)序驗(yàn)證。純化重組質(zhì)粒,紫外分光光度計(jì)定量后根據(jù)分子量換算為分子拷貝數(shù),稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,產(chǎn)生梯度濃度:109、107、105、103、10作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。
　　 10、實(shí)時(shí)定量PCR
　　 采用SYBR Green法,應(yīng)用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行定量檢測(cè),以GAPDH為內(nèi)參照,標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。反應(yīng)體系為25μl,其中S

12、YBR Premix Ex Taq12.5μl,ROX Reference DyeII0.5μl,上下游引物各0.5μl,cDNA模板1μl,H2O10μl。反應(yīng)條件為:95℃5sec,60℃34sec,40個(gè)循環(huán),溶解曲線的條件為95℃15 sec,60℃1 min,95℃15 sec。反應(yīng)結(jié)束后電腦用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)和CT值自動(dòng)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,并可根據(jù)待測(cè)樣本目的基因和內(nèi)參基因的CT值計(jì)算出TLR7和TLR8mRNA的拷貝數(shù)

13、。每一份標(biāo)本均行復(fù)管檢測(cè),取其均值做為目的基因的表達(dá)水平。
　　 11、TNF-α和IL-12p40的檢測(cè)
　　 采用ELISA方法,按照TNF-α和IL-12p40試劑盒的說明書進(jìn)行操作,定量檢測(cè)單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-12p40的含量。
　　 12、EasyQ測(cè)定HIV病毒載量
　　 樣本量200μl,檢測(cè)范圍為＞10U/ml.
　　 13、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有資料采用

14、SPSS11.5軟件分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用LSD檢驗(yàn)對(duì)不同患者組和健康對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較,Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析,不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-Whitngy U test進(jìn)行比較,Spearman rank進(jìn)行相關(guān)性分析,數(shù)據(jù)處理成均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,統(tǒng)計(jì)概率采用雙側(cè)檢驗(yàn),P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、HIV/AIDS患者外周血單核細(xì)胞TLR7和TLR8的mRNA表達(dá)
　　 T

15、LR7 mRNA的表達(dá):緩慢進(jìn)展組高于HIV感染組、AIDS組和健康對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):HIV感染組高于AIDS組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);健康對(duì)照組高于AIDS組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HIV感染組與健康對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);TLR8 mRNA的表達(dá):緩慢進(jìn)展組和健康對(duì)照組高于AIDS組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);緩慢進(jìn)展組高于HIV感染組,HIV感染組高于AIDS組,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

16、義(P＞0.05);緩慢進(jìn)展組高于健康對(duì)照組,健康對(duì)照組高于HIV感染組,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2、HIV/AIDS患者單核細(xì)胞TLR7和TLR8 mRNA的表達(dá)水平與CD4細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性
　　 63例HIV/AIDS患者單核細(xì)胞TLR7mRNA的表達(dá)水平與CD4+細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)(r=0.614,P＜0.01);TLR8mRNA的表達(dá)水平與CD4+細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān),(r=0.419,P＜0.

17、01)。
　　 3、TLR7和8介導(dǎo)的mV感染者單核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12p40
　　 水平:
　　 外周血單核細(xì)胞體外培養(yǎng)上清中未檢測(cè)到TNF-α和IL-12p40。經(jīng)TLR7和8的配體R848刺激后TNF-α和IL-12p40的分泌水平顯著增加(P＜0.001)。健康對(duì)照組TNF-α的分泌水平為2708.9±370.3pg/ml,顯著高于HIV感染組1776.04±479.46pg/ml(P=0.04

18、12);健康對(duì)照組IL-12p40的分泌水平為393.8±25.7pg/ml,HIV感染組為519.74±87.9pg/ml,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.414)。
　　 4、TLR7和8介導(dǎo)的單核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12p40的水平與CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的相關(guān)性
　　 經(jīng)Pearson相關(guān)分析得出,10例HIV感染者TLR7和8介導(dǎo)的單核細(xì)胞分泌TNF-α(r=0.864,P=0.0013)和IL-12p40(r=0

19、.774,P=0.0086)的水平與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值呈明顯正相關(guān),且TNF-α與IL-12p40的分泌水平也呈明顯正相關(guān)(r=830,P=0.003)
　　 5、單核細(xì)胞TLR7和8經(jīng)R848活化后表達(dá)變化
　　 R848刺激單核細(xì)胞后TLR7表達(dá)明顯下調(diào)(P=0.025,Wilcoxon秩和檢驗(yàn)),TLR8表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　 6、單核細(xì)胞TLR7的表達(dá)水平與TNF-α和IL-12p

20、40分泌水平的關(guān)系
　　 HIV感染者單核細(xì)胞TLR7表達(dá)與其介導(dǎo)的TNF-α和IL-12p40的分泌水平?jīng)]有相關(guān)性(P＞0.05)。單核細(xì)胞TLR7表達(dá)的下調(diào)水平與TNF-α和IL12-p40分泌水平也沒有相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 7、單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中HIV病毒載量與CD4+T細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系
　　 9例HIV感染者中,有6例HIV感染者單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中出現(xiàn)低水平的HIV復(fù)制,3例未檢測(cè)到HIV復(fù)制。為

21、了解CD4+T細(xì)胞與HIV復(fù)制水平的關(guān)系,我們將6例出現(xiàn)HIV復(fù)制的HIV感染者按照CD4+T細(xì)胞數(shù)量分為兩組(＞400/ml和＜400/ml),發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞數(shù)＜400/ml組的HIV病毒載量顯著高于CD4+T細(xì)胞數(shù)量＞400/ml組(P=0.031)。
　　 8、R848刺激單核細(xì)胞TLR7和8后對(duì)單核細(xì)胞內(nèi)HIV復(fù)制的作用
　　 9例HIV感染者的單核細(xì)胞體外經(jīng)R848刺激后有5例HIV復(fù)制水平顯著降低(P=0

22、.043,Wilcoxon檢驗(yàn)),有1例HIV的復(fù)制升高,3例HIV感染者單核細(xì)胞經(jīng)R848刺激前和刺激后均未檢測(cè)出HIV復(fù)制。
　　 結(jié)論：
　　 1、HIV/AIDS患者不同疾病進(jìn)程外周血單核細(xì)胞TLR7和TLR8表達(dá)水平不同,緩慢進(jìn)展組高于HIV感染組,HIV感染組高于AIDS組;
　　 2、HIV/AIDS患者外周血單核細(xì)胞TLR7和TLR8表達(dá)水平與CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯正相關(guān);
　　 3

23、、TLR7的活化能夠引起自身表達(dá)的下調(diào),TLR8的活化未引起自身表達(dá)的變化;
　　 4、TLR7和8能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,細(xì)胞因子分泌水平與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)。HIV感染者單核細(xì)胞TLR7和8介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌水平具有保護(hù)性調(diào)節(jié)作用;
　　 5、HIV感染者外周血單核細(xì)胞中存在可復(fù)制的HW病毒顆粒,且復(fù)制水平與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān);
　　 6、HIV感染者單核細(xì)胞TLR7和8的活化能夠抑制HIV復(fù)制,這種抑制