TLR3、TLR7受體在呼吸道合胞病毒感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)I型干擾素中的作用研究.pdf

1、目的：
　　探討呼吸道合胞病毒（respiratory syncytialvirus，RSV）感染人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（A549）后，Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）3、7的水平變化，初步研究TLR3和TLR7活化后在RSV感染中介導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素（interferon，IFN）抗病毒作用及其可能的調(diào)控機制，為臨床預(yù)防與治療RSV的感染提供新的思路。
　　方法：
　　以RSV感染A549細(xì)

2、胞后，分為正常對照組、RSV感染組、TLR3小干擾RNA（TLR3siRNA）沉默組、TLR7小干擾RNA（TLR7siRNA）沉默組。分別于感染的4h、8h、12h和24 h后收集各組細(xì)胞以及上清液，以未感染病毒的細(xì)胞組為正常對照組。
　?。?）用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，半定量RT-PCR法檢測各組TLR3、TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor3，IRF3）、干擾素調(diào)節(jié)因

3、子7（IRF7）、干擾素α（IFN-α）、干擾素β（IFN-β）的mRNA表達(dá)量變化；
　?。?）免疫印跡法（Western-blot）檢測RSV感染A549細(xì)胞各組在4h、8h、12h和24 h的TLR3、TLR7蛋白水平的變化。
　?。?）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測感染不同時間點細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β含量的變化。
　?。?）空斑形成實驗（plaque forming un

4、it，PFU）測定感染A549細(xì)胞的RSV病毒滴度以及各組病毒增殖情況。
　　結(jié)果：
　　①在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，感染組上調(diào)TLR3/7、IRF3/7、IFN-α/β的mRNA基因表達(dá)；在兩沉默組，TLR3/7、IRF3/7、IFN-α/β的mRNA較感染組相同時間點的表達(dá)量明顯減少，減少有統(tǒng)計學(xué)差異；TLR3 siRNA沉默組，IFN-β下降較IFN-α更為顯著，而在TLR7 siRNA沉默組，IFN-α下降較IFN-β更為

5、顯著。
　?、谠诘鞍妆磉_(dá)水平，RSV感染組上調(diào) TLR3、TLR7蛋白的表達(dá)；在兩沉默組，TLR3和TLR7蛋白量比感染組相同時間點的表達(dá)量減少；且在TLR3 siRNA沉默組，TLR3蛋白量下降較TLR7更明顯，TLR7 siRNA沉默組，TLR7的蛋白表達(dá)量較TLR3蛋白量下降更明顯；
　?、跼SV感染A549細(xì)胞后，明顯上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-α/β和炎性因子TNF-α、IL-1β的分泌量，兩沉默組IFN-α/β的量

6、均下降，炎性因子的量升高，在TLR3 siRNA沉默組IFN-β較IFN-α下降的更明顯，炎性因子升高的更明顯；TLR7 siRNA沉默組IFN-α的量下降的更明顯。
　?、躌SV感染組，病毒增殖滴度隨時間的延長而上調(diào)；兩沉默組的病毒增殖滴度都較感染組高，且 TLR3 siRNA沉默組較TLR7 siRNA沉默組病毒增殖滴度更高。
　　結(jié)論：
　　本實驗證明，RSV感染A549細(xì)胞后，TLR3及TLR7被活化能夠抵抗呼