呼吸道合胞病毒感染單核細(xì)胞調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群增殖的研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道疾病最重要的病原，可導(dǎo)致包括肺炎和支氣管炎在內(nèi)的嚴(yán)重的呼吸道疾病。在全球，每年會(huì)造成6，400萬(wàn)例感染病例和16萬(wàn)例死亡病例。由于RSV致病機(jī)理不清，目前對(duì)于RSV感染尚無(wú)有效的疫苗或特異性抗病毒藥物，因此迫切需要對(duì)其致病機(jī)理進(jìn)行深入研究。
　　研究表明，免疫調(diào)控在RSV致病中具有重要的作用，主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)失衡，但其具體機(jī)理尚不清楚。單核細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，

2、在機(jī)體損傷治愈、抗御病毒入侵和對(duì)疾病的免疫方面起著重要的作用。但是單核細(xì)胞在RSV致病機(jī)理中的作用并不清楚，特別是其與RSV感染導(dǎo)致的機(jī)體CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)紊亂的關(guān)系尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。
　　為觀察RSV能否通過感染單核細(xì)胞調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群的增殖，用RSV感染單核細(xì)胞，感染后的單核細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)7天后，收獲細(xì)胞檢測(cè)增殖的CD4+T細(xì)胞中Th1、Th2、Th17和Treg亞群的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSV感染的單核細(xì)

3、胞可降低Treg的比例，增加Th2的比例，但對(duì)Th1和Th17的比例無(wú)顯著影響。研究結(jié)果提示，RSV感染的單核細(xì)胞可以調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群的增殖。
　　單核細(xì)胞可以分為CD16+和CD16-兩個(gè)亞群，為闡明介導(dǎo)RSV調(diào)控作用的具體單核細(xì)胞亞群，通過流式細(xì)胞分選儀將單核細(xì)胞分選為CD16+和CD16-兩個(gè)亞群。采用相同滴度的RSV分別感染CD16+和CD16-單核細(xì)胞，結(jié)果顯示RSV感染CD16+單核細(xì)胞的效率更高。將RSV感染的

4、CD16+和CD16-單核細(xì)胞分別與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)一周后，檢測(cè)RSV感染的兩種單核細(xì)胞亞群對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群增殖的影響。結(jié)果顯示RSV感染的CD16+單核細(xì)胞可以顯著降低Treg細(xì)胞比例，同時(shí)增加Th2細(xì)胞比例。而RSV感染的CD16-單核細(xì)胞無(wú)明顯調(diào)控作用。該結(jié)果表明RSV可通過感染CD16+單核細(xì)胞調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群的增殖。
　　為初步研究RSV感染后CD16+單核細(xì)胞調(diào)控CD4+T細(xì)胞亞群增殖的機(jī)理，將RSV感染

5、的CD16+單核細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共孵育，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入多種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、IL-27和TNF-α）的中和抗體及其對(duì)照抗體，來(lái)觀察CD4+T細(xì)胞中Treg以及Th2的比例變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中和IL-10后，RSV感染的CD16+單核細(xì)胞對(duì)Treg的抑制作用減弱，同時(shí)檢測(cè)了單核細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系上清中多種細(xì)胞因子的濃度，結(jié)果顯示在加有RSV感染的CD16+單核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組中，IL

6、-10的水平顯著上升，提示IL-10可能介導(dǎo)了RSV對(duì)Treg的抑制作用;中和IL-1β和TNF-α后，RSV感染的CD16+單核細(xì)胞對(duì)Th2的促進(jìn)作用減弱，提示IL-1β和TNF-α可能介導(dǎo)了RSV對(duì)Th2的促進(jìn)作用。
　　為了進(jìn)一步研究RSV病毒蛋白在上述免疫調(diào)控中的作用，設(shè)計(jì)了一條創(chuàng)新性的技術(shù)路線快速構(gòu)建了多種可誘導(dǎo)性表達(dá)RSV蛋白的細(xì)胞系。將不同的RSV病毒蛋白基因分別克隆到含有PiggyBac轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)的Cumate誘導(dǎo)

7、表達(dá)載體上，與PiggyBac轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，利用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，并用Cumate誘導(dǎo)病毒蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞儀及Western blot檢測(cè)結(jié)果均表明，加入誘導(dǎo)劑Cumate后，篩選的細(xì)胞系中開始表達(dá)相應(yīng)的病毒蛋白，提示細(xì)胞系構(gòu)建成功。從而證明了利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子可以高效率的構(gòu)建誘導(dǎo)性表達(dá)RSV病毒蛋白的細(xì)胞系。該項(xiàng)工作為研究RSV病毒蛋白在上述免疫調(diào)控中的作用打下了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，發(fā)現(xiàn)RSV能夠