NS2在呼吸道合胞病毒感染A549細(xì)胞活化TLR7中的作用研究.pdf

1、目的：探討呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）非結(jié)構(gòu)蛋白NS2在RSV感染人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（A549）過程中轉(zhuǎn)錄水平的變化情況，研究NS2在RSV感染A549細(xì)胞活化TLR7中的作用機(jī)理，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，為防治呼吸道合胞病毒感染提供新的思路。
　　方法：以RSV感染體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，設(shè)立正常對照組、RSV感染組、RSV NS2小干擾RNA（NS2 siRNA）沉默組及TLR7激動劑（

2、Resiquimod，R848）組。各組分別于病毒感染后的4h、12h、24h、48h收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。（1）實(shí)時熒光定量PCR法（real-time PCR）檢測各組不同時間點(diǎn)RSV NS2，TLR7 mRNA表達(dá)量變化；（2）免疫印跡法（Western-blot）檢測各組不同時間點(diǎn)IFN-βToll樣受體相關(guān)區(qū)域連結(jié)蛋白（TIR domain-containing adapter inducing interferon IFN-

3、β，TRIF），腫瘤壞死因子相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）及磷酸化NF-κB/P65抑制蛋白（Phosphorylated inhibitor of nuclear factor kappa B kinase，p-IκB-α）蛋白水平的表達(dá)變化；（3）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中INF-α，INF-β含量的變化。
　　結(jié)果：（1）Real-time

4、PCR結(jié)果顯示：RSV感染后TLR7 mRNA表達(dá)上升，在感染的48h達(dá)到了正常對照組的8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；在R848+RSV組，TLR7 mRNA表達(dá)量顯著升高，在感染的48h達(dá)到了正常對照組的17.3倍，與RSV感染組相比，TLR7 mRNA表達(dá)量升高，感染24h表達(dá)量為RSV感染組的1.2倍，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；在NS2 siRNA+RSV組，TLR7 mRNA表達(dá)量較正常對照組顯著上升，但較RSV

5、感染組下降，感染的48h表達(dá)量為RSV感染組的70%，差異從12h開始具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RSV感染后NS2 mRNA表達(dá)上升，在R848+RSV組，NS2 mRNA表達(dá)量具有感染時間依賴性，與RSV感染組相比，NS2 mRNA表達(dá)量升高，感染24h時表達(dá)量為RSV感染組的1.1倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.01）。在NS2 siRNA+RSV組，NS2 mRNA表達(dá)量較RSV感染組下降，且從感染12h開始顯著下降，感染的2

6、4h僅為RSV感染組的38%，48h為39%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（12h，P<0.05；24h、48h，P<0.01）。結(jié)果表明RSV感染能夠上調(diào)TLR7 mRNA的表達(dá)，在RSV感染A549細(xì)胞活化TLR7過程中，NS2發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。
　　（2）Western-Blot結(jié)果顯示：正常對照組中，TRIF、TRAF6和p-IκB-α蛋白的表達(dá)量較低，經(jīng)RSV感染之后，隨感染時間增加，表達(dá)量增加，升高有顯著性差異（P<0.01）

7、；在R848+RSV組，TRIF、TRAF6和p-IκB-α蛋白表達(dá)量較RSV感染組增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在NS2 siRNA+RSV組，TRIF、TRAF6和p-IκB-α蛋白表達(dá)量較正常對照組上調(diào)，但相對于RSV感染組，表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明RSV NS2可以活化TRIF，TRAF6及p-IκB-α蛋白的表達(dá)。
　?。?）ELISA法結(jié)果顯示：與正常組細(xì)胞培養(yǎng)上清相比，RSV感染

8、組IFN-α，IFN-β含量升高，從4h開始升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），隨著感染時間的延長而增加；在R848+RSV組，IFN-α，IFN-β含量亦隨感染時間的延長逐漸增加，感染4h升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在NS2 siRNA沉默組，IFN-α，IFN-β含量隨感染時間量逐漸增加，與 RSV感染組相比，有所升高，且從感染4h開始，差異有顯著性（P<0.01），說明在病毒感染過程中，NS2抑制了IFN-α，IFN-β的表達(dá)