TLR4與核仁素受體在呼吸道合胞病毒感染中樞神經(jīng)元所致?lián)p傷中的介導(dǎo)作用.pdf

1、目的:
　　探討呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）感染中樞神經(jīng)元細(xì)胞（neuron2a,N2a），細(xì)胞膜上的Toll樣受體4（Toll-like receptor4,TLR4）和核仁素受體（Nucleolin,NCL或C23）的變化情況，研究TLR4和核仁素受體在RSV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致?lián)p傷中的介導(dǎo)作用，為臨床RSV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　方法:

2、　　以RSV感染體外培養(yǎng)的N2a細(xì)胞，并通過(guò)siRNA沉默TLR4、核仁素受體表達(dá)，分別于感染后1、2、4、12、24和48h不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。（1）激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)TLR4、核仁素受體與RSV F蛋白結(jié)合情況，以及神經(jīng)核蛋白（NeuN）在N2a細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的表達(dá)變化；（2）用TRIzol法提取N2a細(xì)胞總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)TLR4、C23 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化；（3）免疫印跡法（Western

3、-blot）檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)TLR3、TLR4、TLR7、C23以及NF-κB蛋白水平的表達(dá)變化；(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況；（5）空斑形成實(shí)驗(yàn)（plaque forming unit，PFU）檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒增殖的滴度；（6）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和TNF-α炎癥因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　（1）激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，TLR4和C23受體在N

4、2a細(xì)胞膜表面可以結(jié)合RSV F蛋白，在RSV感染1、2和4h的入胞過(guò)程中，隨著感染時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)，F(xiàn)蛋白與TLR4和C23的結(jié)合逐漸增加；TLR4被干擾后，RSV F蛋白標(biāo)記的藍(lán)色熒光表達(dá)強(qiáng)度較RSV感染組和C23 siRNA組降低，表明TLR4與F蛋白結(jié)合減少，RSV在N2a細(xì)胞內(nèi)增殖能力減弱；C23受體沉默后，核仁素受體與F蛋白結(jié)合減少，但可見(jiàn)TLR4結(jié)合更多F蛋白，提示TLR4可結(jié)合更多的RSV進(jìn)入N2a細(xì)胞增殖；RSV感染組中N

5、2a細(xì)胞中NeuN標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較TLR4 siRNA、C23 siRNA組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯降低。
　　（2）在mRNA轉(zhuǎn)錄水平，TLR4和C23在感染1-4h的入胞過(guò)程表達(dá)量逐漸增高，4h后表達(dá)量降低，說(shuō)明TLR4和C23在細(xì)胞膜上識(shí)別RSV入胞過(guò)程中具有重要的作用；在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA后，TLR4和C23蛋白的表達(dá)雖有上調(diào)，但表達(dá)量都比RSV感染組同時(shí)間點(diǎn)明顯下降，且下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在加入C23 siRNA后

6、，TLR4和C23 mRNA表達(dá)比RSV感染組同一時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量降低。
　?。?）Western blot法測(cè)定結(jié)果顯示，正常對(duì)照組中TLR4和C23蛋白表達(dá)量較低，在RSV感染組，TLR4和C23蛋白在感染的1、2和4h表達(dá)水平開(kāi)始增強(qiáng)，4h達(dá)到最高表達(dá)量，4h后開(kāi)始下降，至感染的48h時(shí)，TLR4和C23蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組一直處于增強(qiáng)狀態(tài)；在TLR4或C23 siRNA組，TLR4和C23蛋白表達(dá)雖有上調(diào)，但表達(dá)量都比R

7、SV感染組同時(shí)間點(diǎn)明顯下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RSV感染組中TLR3/TLR7/NF-κB蛋白表達(dá)升高具有時(shí)間依賴性；在C23 siRNA組，TLR3/TLR7/NF-κB蛋白的表達(dá)量雖有上調(diào)，仍比RSV感染組同時(shí)間點(diǎn)降低；在給予TLR4 siRNA處理后，TLR3/TLR7/NF-κB與RSV感染組和C23 siRNA組同時(shí)間點(diǎn)相比降低的更明顯，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過(guò)阻斷TLR4或C23受體的表達(dá)，可以降低TLR3/TLR7/NF-

8、κB在RSV感染N2a細(xì)胞過(guò)程中的活化過(guò)程。
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，RSV感染N2a細(xì)胞48h，可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡與晚期凋亡，晚期凋亡比例大于早期凋亡；TLR4 siRNA組和C23 siRNA組凋亡比例比RSV感染組凋亡比例下降，可見(jiàn)TLR4或C23阻斷后，可以降低RSV感染N2a細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生。
　?。?）PFU結(jié)果顯示，RSV感染N2a細(xì)胞培養(yǎng)上清中RSV滴度隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；分別給予TLR4或C2

9、3 siRNA干擾后，RSV復(fù)制滴度水平較RSV感染組明顯減少，TLR4 siRNA組較RSV感染組和C23 siRNA組病毒的滴度下降的更為明顯，TLR4受體在識(shí)別RSV過(guò)程中可能具有更重要的作用。
　　（6）ELSIA法結(jié)果顯示，RSV感染組IL-6、IL-8和TNF-α炎癥因子隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高；轉(zhuǎn)染TLR4 siRNA后，IL-6、IL-8和TNF-α的含量與RSV感染組同時(shí)間點(diǎn)相比降低更明顯；在C23 siRNA