γδ T細(xì)胞在呼吸道合胞病毒感染影響過(guò)敏性氣道炎癥反應(yīng)中的作用.pdf

1、前言:
　　 支氣管哮喘(bronchialasthma)是由多種細(xì)胞、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子共同參與的,以氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的疾病。Th1/Th2失衡是其主要的免疫學(xué)改變,也是氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。病毒感染因影響Th1/Th2平衡而成為哮喘形成和發(fā)作的重要誘因。引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和肺炎的主要病原體是呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV),其與哮喘的相關(guān)性研究受到高

2、度重視。研究提示RSV感染不僅是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要影響因素,而且RSV感染時(shí)機(jī)影響機(jī)體Th1/Th2平衡及氣道變態(tài)炎癥反應(yīng)結(jié)果,但在此過(guò)程中有哪些因素參與其中并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用尚不清楚。
　　 廣泛分布于皮膚粘膜系統(tǒng)的γδT細(xì)胞作為具有免疫學(xué)效應(yīng)和調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群,影響呼吸道粘膜局部病原體感染模式和過(guò)敏性炎癥反應(yīng)過(guò)程。γδT細(xì)胞在RSV感染對(duì)氣道變態(tài)炎癥反應(yīng)的影響過(guò)程中具有怎樣的生物學(xué)作用,目前尚不清楚。為此,本研究利用

3、OVA誘發(fā)的哮喘模型鼠,采用致敏前、后RSV感染模式,深入探討在RSV感染對(duì)氣道變態(tài)炎癥發(fā)生發(fā)展影響過(guò)程中,γδT細(xì)胞的作用以及免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制。將RSV感染、γδT細(xì)胞、過(guò)敏性哮喘三者聯(lián)系起來(lái),從新的視角闡明病毒感染影響哮喘形成和發(fā)作的機(jī)理,為臨床評(píng)價(jià)呼吸道病毒感染預(yù)后及防治支氣管哮喘提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)用試劑
　　 試劑:卵清蛋白(OVA)、HE染液、瑞氏染液、膠原酶Ⅰ

4、、DnaseⅠ、淋巴細(xì)胞分離液、水合氯醛、RPMI-1640培養(yǎng)液、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、0.01MPBS緩沖液、紅細(xì)胞裂解液、胰酶、熒光標(biāo)記單克隆抗體(PE-anti-TCRδmAb;FITC-anti-CD40LmAb;FITC-anti-CD69mAb)等。
　　 試劑盒:ELISA檢測(cè)試劑盒、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-timeRT-PCR試劑盒。
　　 2、病毒的繁殖與滴定
　　 用Hep-2細(xì)

5、胞繁殖人類(lèi)呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2),30%蔗糖超速離心法分離病毒,-80℃冰箱保存。病毒滴度用組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)表示。
　　 3、實(shí)驗(yàn)性哮喘動(dòng)物模型
　　 動(dòng)物:將購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組,每組8只,分別是實(shí)驗(yàn)組,包括致敏前RSV感染組(RSV/OVA)和致敏后RSV感染組(OVA/RSV)以及對(duì)照哮喘組(OVA)。
　　 哮喘模

6、型:小鼠二次腹腔注射0.1ml含20pgOVA和2.25mg氫氧化鋁的乳化液致敏,二次注射間隔為2周。末次致敏后第14天,小鼠吸入超聲霧化的1%OVA生理鹽水20分鐘,每天1次,持續(xù)3天。末次霧化吸入后第2天收集標(biāo)本。
　　 RSV感染模式:病毒感染時(shí)間選擇在初次致敏前第7天(致敏前RSV感染)和末次致敏后第7天(致敏后RSV感染)。經(jīng)鼻粘膜感染20μl含2×106TCID50RSV的病毒懸液。
　　 4、標(biāo)本采集與檢測(cè)

7、方法
　　 (1)肺組織病理標(biāo)本制作及染色:取模型鼠左肺下葉,制備石蠟切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)情況。
　　 (2)肺組織淋巴細(xì)胞的提取:水合氯醛深度麻醉小鼠,經(jīng)心臟灌流去除血管內(nèi)血細(xì)胞后取肺組織。用含有200μg/ml膠原酶Ⅰ和30μg/mlDnaseⅠ的培養(yǎng)液消化處理肺組織,淋巴細(xì)胞分離液分離肺淋巴細(xì)胞。
　　 (3)肺泡灌洗液(BALF)的收集及炎性細(xì)胞的分類(lèi)與計(jì)數(shù):用1ml

8、PBS經(jīng)支氣管沖洗肺組織,收集肺泡灌沈液。離心后取細(xì)胞懸液作涂片,瑞氏染色后顯微鏡下隨機(jī)選擇視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,分別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。
　　 (4)ELISA法檢測(cè)血清中過(guò)敏原特異性抗體含量:10μg/mlOVA包被96孔板,4℃過(guò)夜后1%BSA封閉30分鐘,加稀釋的血清樣本培養(yǎng)1小時(shí)后,分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗體,鄰苯二胺顯色,490nm波長(zhǎng)讀取OD值從標(biāo)準(zhǔn)

9、曲線獲取血清抗體含量。
　　 (5)實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA水平:用RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA,采用Real-timeRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4的mRNA表達(dá)水平。
　　 (6)脾細(xì)胞分離及其懸液制備:頸椎脫位處死小鼠,常規(guī)無(wú)菌制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml。
　　 (7)流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾和肺組織中

10、活化的γδT細(xì)胞數(shù)量:調(diào)整小鼠淋巴細(xì)胞濃度至1×106/ml。加入PE標(biāo)記的anti-TCRδmAb以及FITC標(biāo)記的anti-CD40LmAb或anti-CD69mAb,避光冰浴30分鐘,冷的PBS洗滌兩次,震蕩混勻細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。
　　 (8)γδT細(xì)胞回輸實(shí)驗(yàn):末次霧化吸入后第2天無(wú)菌分離OVA組小鼠脾淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞分選儀分選PE-anti-TCRδmAb標(biāo)記的γδT細(xì)胞,用RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/

11、ml,從小鼠尾靜脈回輸分選的γδT細(xì)胞,2×104/鼠,細(xì)胞回輸時(shí)間為初次霧化吸入前1小時(shí)。
　　 (9)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以-X±S表示,組間比較采用t檢驗(yàn)分析。P＜0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、致敏前感染RSV減輕哮喘鼠肺炎癥反應(yīng)
　　 經(jīng)OVA致敏和激發(fā)的BALB/c鼠氣道上皮增厚、管腔狹窄、肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞、中

12、性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。致敏前感染RSV顯著抑制OVA誘導(dǎo)的肺炎癥反應(yīng),減輕模型鼠肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。但致敏后RSV感染卻對(duì)OVA誘發(fā)的氣道炎癥無(wú)明顯影響。
　　 2、致敏前RSV感染降低哮喘鼠肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量
　　 OVA哮喘鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。致敏前RSV感染降低哮喘鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量,但致敏后RSV感染對(duì)小鼠肺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)明顯

13、影響。
　　 3、致敏前RSV感染降低哮喘鼠血清總IgE和過(guò)敏原特異性IgE、IgG1抗體水平
　　 二次腹腔注射和三次霧化吸入明顯升高BALB/c鼠血清總IgE和OVA特異性IgE、IgG1水平。而致敏前RSV感染降低哮喘模型鼠血清總IgE、OVrA特異性IgE和IgG1含量。但致敏后RSV感染對(duì)OVA特異性血清抗體的產(chǎn)生無(wú)明顯影響。
　　 4、致敏前感染RSV影響哮喘鼠肺細(xì)胞Th1/Th2型細(xì)胞因子mRNA表

14、達(dá)
　　 致敏前RSV感染明顯抑制哮喘鼠肺組織細(xì)胞IL-4mRNA的表達(dá),但增強(qiáng)肺局部IFN-γmRNA表達(dá)水平。與OVA組相比,RSWOVA組小鼠肺組織IL-4mRNA由0.39±0.08降低至0.28±0.07,而IFN-γmRNA水平由0.11±0.05升高至0.23±0.12。與此相反,致敏后感染RSV對(duì)OVA誘導(dǎo)的Th1/Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　 5、致敏前感染RSV降低哮喘鼠脾及肺組

15、織內(nèi)γδT細(xì)胞總數(shù)及其活化細(xì)胞數(shù)量
　　 致敏前感染RSV顯著降低哮喘鼠脾和肺組織內(nèi)γδT細(xì)胞總數(shù),表達(dá)CD40L和CD69的活化γδT細(xì)胞數(shù)亦因RSV感染而明顯下降。與此相反,致敏后感染RSV則對(duì)哮喘鼠脾和肺組織中γδT細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯影響。
　　 6、γδT細(xì)胞參與RSV感染對(duì)哮喘鼠氣道變態(tài)炎癥的影響作用
　　 正常小鼠回輸了來(lái)自O(shè)VA哮喘鼠的γδT細(xì)胞后,肺炎性細(xì)胞數(shù)量明顯上升,其中嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞百