重組呼吸道合胞病毒蛋白疫苗研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)屬于副粘病毒科肺病毒屬，是引起嬰幼兒嚴(yán)重呼吸道疾病的主要病原體。RSV存在極高的重復(fù)感染率，直至第三次感染時(shí)病癥才有所減輕。迄今，尚無成功的疫苗問世。目前在研的候選疫苗有減毒活疫苗及表達(dá)G蛋白的病毒載體。一種名為FG的嵌和糖蛋白在以棉鼠為動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，它能夠有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，并能抵抗鼻腔途徑的病毒攻擊。其它處于實(shí)驗(yàn)中疫苗還包括DNA疫苗，重組蛋白疫

2、苗和活載體疫苗等。 雖然已經(jīng)證明人體的血清抗體能有效的中和病毒，但即使高滴度的中和抗體也不能排除嚴(yán)重的RSV感染。最為嚴(yán)重的感染往往發(fā)生在母體抗體滴度最高的嬰兒時(shí)期。有證據(jù)表明，血清中的中和抗體有利于保護(hù)下呼吸道，但不能阻止重復(fù)感染。也就是說，體液免疫對RSV感染提供的保護(hù)是很不完全的。CD8+CTL在抗RSV感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因此，一個(gè)理想的疫苗應(yīng)該能誘導(dǎo)保護(hù)性細(xì)胞免疫，以提高免疫保護(hù)水平，抑制感染的傳播。有

3、鑒于此，本文設(shè)想發(fā)展一種既能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫也能產(chǎn)生體液免疫的新型重組蛋白疫苗。 以此為目標(biāo)，本研究首先克隆了RSVG蛋白基因，該蛋白含有誘導(dǎo)中和抗體的表位。本文首先通過RT-PCR，從A亞型病毒中擴(kuò)增獲得G蛋白基因的全長DNA，經(jīng)測序和同源性比對，它與同亞型病毒G蛋白核苷酸的同源性為91％，氨基酸同源性為93％。插入全長cDNA的載體命名為pUC18(G10)。 在此基礎(chǔ)上，通過PCR擴(kuò)增了3個(gè)G蛋白片段，分別為G101，

4、G126和G151，對應(yīng)于G蛋白的125-225，100-225或75-225aa。這些G蛋白片段將被用作體液免疫抗原，誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。為了提高G蛋白片段的免疫原性，選用了DsbA，CKS，MBP和GST等4個(gè)載體蛋白，并將載體蛋白連接在G蛋白片段的N端進(jìn)行融合表達(dá)。總共獲得了14個(gè)表達(dá)載體，它們是pET-15b(DsbA-G101)，pET-15b(DsbA-G126)，pET-15b(DsbA-G151)，pET-15b(CKS-

5、G101)，pET-15b(CKS-G126)，pMBP-P-G101，pMBP-P-G126，pET-15b(GST-G101)，pET-15b(DsbA)，pET-15b(CKS)，pMBP-P-G101，pMBP-P和pET-15b(GST)。這些載體表達(dá)的重組蛋白抗原為DsbA-G101，DsbA-G126，DsbA-G151，CKS-G101，CKS-G126，MBP-G101，MBP-G126，GST-G101，DsbA，C

6、KS，MBP和GST。構(gòu)建這一系列載體的目的是希望通過比較，可以從中發(fā)現(xiàn)最佳的載體蛋白和G蛋白片段抗原。 上述表達(dá)載體被導(dǎo)入E.coli，并獲得成功表達(dá)。重組蛋白表達(dá)含量最高可達(dá)71％，最低者小于10％。大多數(shù)重組蛋白抗原獲得可溶形式或者部分可溶形式表達(dá)。其中，DsbA，DsbA-G101，DsbA-G126和DsbA-G151等4個(gè)重組蛋白經(jīng)大量表達(dá)后，通過親和層析獲得純化。通過凝血酶切割和第二次親和層析，獲得了單獨(dú)的G101

7、片段。 經(jīng)免疫Balb/c小鼠證實(shí)，純化的DsbA-G101，DsbA-G126和DsbA-G151能在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體。針對抗原自身的ELISA抗體滴度為log104.9～5.3，針對G101的抗體滴度為log104.6～4.8，而針對RSV的抗體滴度為log102.7～3.5。分析抗體產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)曲線發(fā)現(xiàn)，重組蛋白抗原可在體內(nèi)很快刺激體液免疫反應(yīng)。在首次免疫的10天后，即可檢測到抗體的產(chǎn)生，較低的抗體滴度為log10

8、3左右，較高的抗體水平達(dá)到log105。通過空斑抑制實(shí)驗(yàn)檢測，血清抗體和粘膜抗體均能在體外抑制病毒的增殖。10倍稀釋的血清抗體對病毒的抑制可達(dá)到60％。在DsbA-G101，DsbA-G126和DsbA-G151等3個(gè)抗原中，DsbA-G126相對更佳，因?yàn)樗T導(dǎo)產(chǎn)生的針對RSV的抗體滴度和中和抗體滴度均是最高的?？傊@些重組蛋白抗原能有效的誘導(dǎo)體液免疫并能成功保護(hù)免疫小鼠不受RSV感染。 獲得長效的體內(nèi)CTL活性是疫苗發(fā)展中

9、需重點(diǎn)考慮的問題之一。為了探尋一種能在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生長效的病毒特異的CTL的方法，本文構(gòu)建了DsbA-F/M2：81-95這一新的重組蛋白。DsbA-F/M2：81-95能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒特異的CTL反應(yīng)，并能為免疫小鼠提供保護(hù)。與單獨(dú)的F/M2：81-95相比，該重組蛋白抗原延長體內(nèi)CTL的壽命達(dá)2.93倍。本研究結(jié)果表明，DsbA刺激產(chǎn)生的非抗原特異的Th反應(yīng)對延長CD8+型的CTL壽命是必要的。 如何發(fā)展一種既能誘導(dǎo)有

10、效的細(xì)胞免疫又能產(chǎn)生有效的體液免疫的疫苗已成為當(dāng)今疫苗設(shè)計(jì)中的挑戰(zhàn)。為此，在本研究中將含有中和抗體表位的抗原DsbA-G101和含有CTL表位的抗原DsbA-F/M2：81-95共免疫Balb/c小鼠，并檢測產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的能力。可喜的是，G蛋白片段的存在能加強(qiáng)由嵌和CTL表位誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL反應(yīng)，雖然G蛋白片段本身不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。相比之下，嵌和CTL表位的存在對誘導(dǎo)抗體反應(yīng)存在不利的影響。在共免疫小鼠中，針對RSV的ELIS

11、A抗體滴度和中和抗體滴度均有所下降。攻擊實(shí)驗(yàn)表明，共免疫能進(jìn)一步降低病毒在小鼠肺組織和鼻腔中增殖，表明共免疫對抵抗病毒更加有效。這一結(jié)果表明，研制能同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫的疫苗將是RSV疫苗發(fā)展的有效策略。在此研究的基礎(chǔ)上，本研究還構(gòu)建了含有中和抗體表位G126和CTL表位F/M2：81-95的新型抗原。Westernblotting結(jié)果顯示，CTL表位的加入不影響中和抗體表位與相應(yīng)抗體的結(jié)合。 總之，本研究為開展RSV