表達人呼吸道合胞病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組腺病毒及桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的:人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)廣泛分布于世界各地,是導(dǎo)致嬰幼兒、老年人和免疫缺陷病人嚴重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。RSV屬于副粘病毒科肺病毒屬,基因組為15.2 Kb的單股負鏈RNA,編碼11種蛋白,其中黏附蛋白(Glycoprotein,G)和融合蛋白(Fusion protein,F)為RSV主要中和抗原,基質(zhì)蛋白(Matrix protein,M)為RSV

2、的骨架蛋白。從福爾馬林滅活疫苗開始,已研制了多種形式的RSV疫苗,但由于安全性和免疫原性等問題,至今尚沒有能夠用于預(yù)防人RSV感染的疫苗問世。病毒樣顆粒疫苗作為一種新型疫苗形式被廣泛用于各種病毒疫苗研制,并獲得較為理想的免疫效果和保護作用。迄今為止,人們對于RSV病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)的制備條件尚處探索階段,僅有的一個關(guān)于RSV VLPs見于2008年美國一份專利申請書,但存在產(chǎn)量低、制備困難及

3、未見免疫效果和免疫保護作用研究。本研究擬選用非復(fù)制型第一代腺病毒載體(First generation replication deficient recombinantadenoviral vector,FGAd)和桿狀病毒表達載體分別構(gòu)建表達RSV F、G、M的復(fù)制缺陷型重組腺病毒及重組桿狀病毒,為進一步闡明RSV VLPs形成和出芽機制,以及獲得RSV VLPs奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:參考GenBank登錄的RSV A

4、亞型Long株M、G蛋白基因序列,按照哺乳動物細胞密碼子偏性,對M和G基因進行密碼子優(yōu)化,然后分別克隆到穿梭載體pShuttle-CMV,再經(jīng)同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染293細胞,獲得重組腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-Msyn,Western-blot鑒定目的基因表達。參考GenBank登錄的RSVA亞型Long株F、G和M蛋白基因序列,按照昆蟲細胞密碼子偏性,對F、G和M基因進行密碼子優(yōu)化,然后分別克隆到穿梭載體pFa

5、st-BacI,轉(zhuǎn)座后獲得重組桿狀病毒質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染sf9細胞,獲得重組桿狀病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt,Western-blot鑒定目的基因表達。
　　 結(jié)果:重組腺病毒DNA分子轉(zhuǎn)染293細胞后,7d左右細胞出現(xiàn)腫脹,圓縮等典型的致細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),Western blot檢測到G和M基因的表達,獲得非復(fù)制型重組腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-M

6、syn。重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細胞后,3d后出現(xiàn)細胞腫脹、細胞核增大和核內(nèi)出現(xiàn)空泡等病變,Western blot檢測到F、G和M基因的表達,獲得重組桿狀病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt。
　　 結(jié)論:成功獲得FGAd-Gsyn、FGAd-Msyn、rBac-Fopt、rBac—Mopt和rBac-Gopt,為闡明RSV VLPs形成和出芽機制,以及獲得RSV VLPs奠定了實驗基礎(chǔ)。