桿狀病毒展示系統(tǒng)的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、將外源基因克隆在桿狀病毒的穿梭載體上，然后轉(zhuǎn)化E.coli DH10B感受態(tài)細(xì)胞并且提取質(zhì)粒，與含有Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)座，在含Kanr/Tetr/X-gal/IPTG的LB固體平板上挑取白色單菌落，提取大質(zhì)粒，在質(zhì)脂體的作用下感染Sf-21細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡的觀(guān)察可以知道基因的表達(dá)情況，此方法即是所說(shuō)的Bac to Bac表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)此方法廣泛的應(yīng)用在病毒、真菌、植物和動(dòng)物的相關(guān)基因表達(dá)。其中武漢大學(xué)的劉鑫博士利用Bac

2、mid-egfp穿梭載體成功地表達(dá)了麻疹病毒受體SLAM，以綠色熒光作標(biāo)記發(fā)現(xiàn)表達(dá)的SLAM蛋白定位在Sf-9細(xì)胞表面，與人類(lèi)細(xì)胞中的自然定位相同。而且Sf-9細(xì)胞表面的SIAM可以介導(dǎo)麻疹病毒對(duì)非受納昆蟲(chóng)細(xì)胞的感染。證明該系統(tǒng)維持了親本Bac to Bac系統(tǒng)的特性和功能，但卻增加了親本Bacmid所不具我們利用兩個(gè)Bac to Bac系統(tǒng)，即基于AcMNPV的Bac to Bac系統(tǒng)(AcBacmid)和帶綠色熒光蛋白基因標(biāo)記的Ac

3、MNPV Bac to Bac系統(tǒng)(AcBacmid-egfp)，通過(guò)位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座，將AcMNPV多角體蛋白基因ph-ph和異源Mcherry和IRES基因轉(zhuǎn)座到兩個(gè)不同的Bacmid基因組中，再轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，構(gòu)建了三種重組穿梭載體：pFBDM-ph-ph，pFBDM-Mcherry和pFastBac1-IE2-red-IRES-egfp。 三種重組穿梭載體分別感染Sf-21細(xì)胞，4-5天后，其中將多角體蛋白基因和綠色熒光蛋白

4、基因的融合表達(dá)盒經(jīng)Bac to Bac系統(tǒng)轉(zhuǎn)座載體的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)座，轉(zhuǎn)到Bacmid基因組上，構(gòu)建成多角體蛋白與綠色熒光蛋白融合的重組穿梭載體Bac-ph-ph/gfp，將陽(yáng)性的Bac-ph-ph/gfp DNA轉(zhuǎn)染Sf-21細(xì)胞后包裝成重組病毒vAc-ph-ph/gfp，ph-ph/EGFP融合蛋白能夠正常表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀(guān)察可以發(fā)現(xiàn)綠色熒光及病毒包涵體，而且綠色熒光只在包涵體顆粒的表面產(chǎn)生，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的其它地方?jīng)]有綠色熒光，

5、這說(shuō)明綠色熒光蛋白通過(guò)與多角體蛋白融合能成功地展示到病毒包涵體的表面。同時(shí)與對(duì)照pFBDM-ph相比包涵體產(chǎn)生數(shù)量比較多，大小不均形狀也不規(guī)則。pFBDM-Mcherry和pFastBac1-IE2-red-IRES-egfp所感染的細(xì)胞不僅有綠色熒光而且有紅色熒光出現(xiàn)，表明了Mcherry和IRES基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞里表達(dá)。同時(shí)用pFBDM-ph-ph和pFBDM-Mcherry感染的上清液混合二次感染Sf-21細(xì)胞，紅色熒光融合在病毒包

6、涵體之中，表明異源的Mcherry蛋白能夠裝配到重組病毒pFBDM-ph-ph的ODV的囊膜上。 最后我們利用同源重組構(gòu)建的一種細(xì)胞壁合成缺陷型的大腸桿菌DHIOB-asd，asd是編碼二氨基庚二酸的基因，是細(xì)胞壁的重要組成。由于asd基因的缺失，所以必須在培養(yǎng)基中加DAP(二氨基庚二酸)細(xì)菌才能合成細(xì)胞壁，pGB2-inv質(zhì)粒含有inv基因，可以表達(dá)侵染蛋白。我們?cè)谶@里轉(zhuǎn)化pGB2-inv質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌DH10B-asd-，

7、然后電轉(zhuǎn)pFBDM-ph-ph-AcBacmid-gfp進(jìn)入大腸桿菌DH10B-asd，構(gòu)建菌株DH10B-asd-inv-PFBDM-ph-ph-Acbacmid-egfp，我們將細(xì)菌菌液與昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf21直接混合。在inv侵染蛋白的介導(dǎo)下，大腸桿菌通過(guò)細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在缺乏DAP的情況下，細(xì)菌不能合成細(xì)胞壁，裂解。pFBDM-ph-ph-AcBacmid-gfp釋放出來(lái)，復(fù)制、裝配、表達(dá)gfP綠色熒光蛋白，同時(shí)里