基于家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源基因研究.pdf

1、家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng),表達的蛋白具有折疊和糖基化,近于真實構(gòu)相,表達量較大,而且能夠可溶性地表達一些原核系統(tǒng)難以表達的大分子量蛋白。我們首先使用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了Mn-SOD基因,并通過低溫冷凍真空干燥,以SOD全蠶粉的形式,保持了SOD的活性。對SOD全蠶粉進行了以《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》為標(biāo)準(zhǔn)的安全性和功能性檢驗。經(jīng)對小鼠進行人體推薦量360倍的急性毒性檢驗、90天的長期性毒性檢驗,小鼠生長正常,各

2、器官無異?，F(xiàn)象發(fā)生；SOD全蠶粉對ConA刺激導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,在體外法實驗中,顯示能明顯增加淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,提示SOD全蠶粉具有免疫調(diào)節(jié)作用；經(jīng)口給予小鼠不同劑量的SOD全蠶粉30天,能提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力,在高劑量組達到顯著水平,但與陽性對照(黃芪組)有較明顯的差距。SOD全蠶粉促進小鼠的體重增長,對脾臟生長無影響,但明顯增加小鼠的胸腺/體重比值；用SRBC免疫小鼠后,產(chǎn)生抗SRBC抗體,SOD全蠶粉對血凝素也有明顯的作用,

3、表明SOD全蠶粉對正常機體的體液免疫功能均有增強作用；經(jīng)對小鼠巨噬細(xì)胞的功能實驗,SOD全蠶粉提高了小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力。
　　 在家蠶體內(nèi)表達SOD基因后,經(jīng)冷凍干燥制得SOD全蠶粉,設(shè)三個劑量組和陰性、陽性對照組給小鼠灌胃；經(jīng)口給予小鼠不同劑量的SOD全蠶粉30天,能增加小鼠血和肝臟中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,降低小鼠肝臟中丙二醛含量。
　　 在家蠶體內(nèi)表達SOD基因后,經(jīng)冷凍干燥制得SO

4、D全蠶粉,小鼠灌胃45天,小鼠尾靜脈注稀釋的印度墨汁,以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力,碳廓清能力提高,說明加速碳粒的清除,顯著提高自然殺傷細(xì)胞抗瘤活性,增強機體的非特異性細(xì)胞免疫功能。以NIH小鼠為研究模型,觀察SOD全蠶粉對NK細(xì)胞活性的影響,證實了SOD全蠶粉有明顯的能增強NK細(xì)胞的活性,從而增強機體的免疫機能。在此基礎(chǔ)上,進行抑制腫瘤實驗,結(jié)果表明提高小鼠抗腫瘤能力,SOD全蠶粉提高S180腫瘤荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、NK細(xì)胞活

5、性,抑制小鼠的腫瘤生長；SOD全蠶粉組對肝癌H22的平均抑瘤率為40.3,表現(xiàn)出較強的抗腫瘤活性,能促進T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,提高NK細(xì)胞活性。
　　 經(jīng)四氧嘧啶造模成功后小鼠,對其灌胃SOD全蠶粉30天(SOD全蠶粉為家蠶體內(nèi)表達SOD基因后,經(jīng)冷凍干燥制得),結(jié)果顯示SOD全蠶粉能增加小鼠的糖耐量水平,對小鼠的空腹血糖值有降低趨勢,達到顯著水平。
　　 家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)是一個功能強大,可利用范圍較廣的真核表達系統(tǒng),然而

6、,由于感染需要節(jié)間注射,限制了家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)的應(yīng)用,因此,我們對家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)進行了幾項攻進。采用熒光增白劑噴灑桑葉,增加家蠶經(jīng)口對桿狀病毒表達系統(tǒng)中攜帶外源基因病毒的易感性。構(gòu)建了雙表達載體系統(tǒng),在表達Mn-SOD目的蛋白的同時,恢復(fù)表達了多角體基因；多角體基因和Mn-SOD基因被分別插在多角體啟動子和P10啟動子之下,實現(xiàn)了經(jīng)口感染。摸索出重組桿狀病毒DNA與轉(zhuǎn)染劑混合比例和轉(zhuǎn)染條件,在家蠶體內(nèi)實現(xiàn)從DNA到病毒的轉(zhuǎn)化,

7、經(jīng)口感染家蠶幼蟲,大大簡化外源基因表達的操作手續(xù)。
　　 表達的目的蛋白在感染后期常被降解,甚至在感染后期家蠶等昆蟲組織器官也受到降解,給目的蛋白的純化等處理帶來許多麻煩,這己成為該表達系統(tǒng),特別是在產(chǎn)業(yè)化開發(fā)時遇到的一個嚴(yán)重的問題。為了解決表達蛋白的穩(wěn)定性。引進和采用了缺少半胱氨酸蛋白酶基因的Bacmid質(zhì)粒載體(CPD),缺少半胱氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶基因的Bacmid質(zhì)粒載體(CPPD),用這些改進后的Bacmid質(zhì)粒載體表