桿狀病毒復制和基因表達的表觀遺傳學調控研究.pdf

1、在過去的三十年里,表觀遺傳學是生命科學研究的一個熱點,產生了許多重大的研究成果。但是病毒學家們似乎對此無動于衷。直到現在,我們能找到的有關病毒的表觀遺傳學調控的文章都很有限。在這里,比起有潛伏感染期的單純皰疹病毒(HSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人類乳頭狀瘤病毒(HPV),裂解性復制病毒復制周期中的表觀遺傳學調控更少被關注。本文重點研究了桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographac

2、alifornicamulticapsidnucleopolyhedrosis,AcMNPV)在昆蟲細胞中進行裂解性復制時的一些表觀遺傳學現象,包括病毒小染色體結構、組蛋白乙?；揎椇虳NA甲基化修飾在桿狀病毒的復制和基因表達中的作用。
　　首先,我們證明了病毒小染色體結構和組蛋白乙?；揎椩诓《净蜣D錄中的作用。我們證實插入在病毒polyhedrin位點下游的雞β-珠蛋白5'-HS4絕緣子(HS4)能顯著提高polyhedrin

3、啟動子控制的報告基因的表達水平。當使用增強型綠色熒光蛋白(egfp)作為報告基因時,在感染后72h和96h,帶HS4的重組病毒(AcEGFP-HS4)感染的昆蟲細胞比不帶HS4的對照病毒(AcEGFP)感染的細胞熒光分別高3倍和2.1倍。AeEGFP-HS4感染的細胞的egfp的mRNA水平也較AcEGFP感染的細胞高。在以螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)或分泌型堿性磷酸酶(SEAP)為報告基因時,也觀察到類似的表達

4、水平的提高。進一步的機制研究表明,polyhedrin位點插入的HS4沒有顯著影響到病毒復制,而HS4的作用具有方向性且對組蛋白乙酰基轉移酶抑制劑敏感。從DNaseI敏感實驗看出,HS4的存在顯著提高了附近DNA對核酸酶的敏感性,但對距離較遠的DNA沒有作用。這些結果表明HS4可能通過改變在病毒形成的小染色體上鄰近染色體結構來影響病毒基因表達。這一研究結果為提高桿狀病毒.昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達目標蛋白的效率提供了新的途徑,也明確提示在桿狀

5、病毒裂解性復制過程中,病毒小染色體的結構及組蛋白的乙?；揎棇Σ《净虻谋磉_起著重要的作用。
　　為了揭示其它表觀遺傳學調控機制在桿狀病毒復制過程中的作用,我們進一步研究了病毒復制過程中的DNA甲基化問題。我們首次證實病毒極早期基因ie0的轉錄受DNA甲基化調控。IE0是病毒的一個重要調控因子,在感染早期表達水平相對較高,而在感染晚期轉錄下調。這種表達水平的變化對病毒復制具有重要意義。我們發(fā)現:在感染后Oh(0hp.i.)ie0啟

6、動子甲基化程度較高,8hp.i.時甲基化程度明顯降低,但從18hp.i.起,這一區(qū)域甲基化程度又明顯提高。體外DNA甲基化修飾實驗表明DNA甲基化可以抑制ie0表達。DNA甲基轉移酶抑制劑(DNMTi)DAC(50nM)的存在有助于維持ie0啟動子低甲基化,并顯著增加ie0的表達。這些研究結果證實啟動子區(qū)域的DNA甲基化是ie0在感染晚期轉錄下調的原因,表明DNA甲基化在裂解性復制病毒基因表達的調控中也有重要作用。
　　為了全局性

7、的了解DNA甲基化調控在病毒復制和基因轉錄中的作用,我們還研究了DAC對病毒復制和基因轉錄的影響。用50nMDAC處理,可使AcMNPV感染Sf9細胞時病毒效價下降到對照的1/30,并顯著地延遲病毒DNA復制。DAC處理對病毒極早期基因的表達在感染后不同階段有不同的影響。在2hp.i.,DAC可以提高病毒極早期基因ie1和ie2的表達,而在感染晚期,DAC抑制把ie1和ie2的轉錄。但是在整個復制周期中,DAC都提高ie0的轉錄。DAC

8、對病毒滯早期基因轉錄的影響不均一,但抑制晚期基因的轉錄。DAC對病毒極晚期啟動子的活性的抑制作用尤為明顯。對于DAC抑制極晚期啟動子的機制我們進行了進一步的研究,發(fā)現用質粒額外表達IE1可以緩解DAC的對極晚期啟動子的抑制作用。這些數據,結合前面的結果和對IE0,IE1功能已有的認識,提示在感染的后期,DAC是通過抑制ie1的轉錄,同時避免ie0轉錄的降低,改變了IE0,IE1兩個蛋白的相對比例,從而抑制了極晚期啟動子的激活。這一研究結

9、果表明DNA甲基化對病毒復制的調控作用可能主要是通過影響關鍵調控因子的轉錄來實現。
　　除了感染昆蟲細胞以外,桿狀病毒還能高效地侵入多種哺乳動物細胞。它作為一種新型哺乳動物轉導載體正在受到越來越多的重視。但目標基因的表達沉默限制了桿狀病毒這方面的應用。盡管人們早已發(fā)現組蛋白去乙酰基轉移酶抑制劑可以提高桿狀病毒介導的基因在哺乳動物細胞中的表達,但另一類引起表觀遺傳學修飾變化的藥物,DNMTi卻被報道沒有這種效果。在本論文中,我們首次

10、發(fā)現在病毒轉導哺乳動物細胞前使用DNMTiAZA或DAC處理細胞,在多種哺乳動物細胞中桿狀病毒介導的基因的表達水平均有四倍的提高;但如果添加藥物的時間推遲,則其提高表達水平的作用會減弱乃至消失。同時在病毒接種期間有DNMTi的存在對其發(fā)揮作用至關重要。進一步的結果表明DNMlTi可能是通過抑制細胞對病毒DNA降解起作用。這項研究為提高桿狀病毒載體在哺乳動物細胞中應用的效果提供了新途徑,也為揭示桿狀病毒與哺乳動物細胞的作用關系,認識哺乳動