31344.桿狀病毒ac76基因的研究

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文桿狀病毒ac76基因的研究姓名：胡朝陽(yáng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：龐義20090606胡朝陽(yáng)桿狀病毒ac76基因的研究生三個(gè)具有共同5’端，大小分別為697nt、724nt、1793nt的轉(zhuǎn)錄本。為了進(jìn)一步研究ac76在病毒復(fù)制周期中的功能，利用ET同源重組技術(shù)和BactoBac系統(tǒng)，在AcMNPVBacmid中成功敲除了ac76，構(gòu)建了缺失ac76的重組病毒。同時(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)座的方法，在缺失了ac76的重

2、組病毒中，將ac76插入到多角體蛋白基因(polh)位點(diǎn)，獲得補(bǔ)回型重組病毒。為了便于觀察多角體形態(tài)和感染進(jìn)程，同樣將綠色熒光蛋白基因和polh也轉(zhuǎn)座進(jìn)重組病毒的polh位點(diǎn)，構(gòu)建了野生型病毒、ac76缺失型重組病毒和ac76補(bǔ)回型重組病毒。分別用野生型、ac76缺失型及ac76補(bǔ)回型重組病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，顯微觀察和病毒生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，ac76缺失型重組病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中不能增殖，不能產(chǎn)生有感染性的芽生型病毒粒子，Weste

3、rnblot檢測(cè)證實(shí)了缺失型重組病毒的轉(zhuǎn)染上清中沒(méi)有病毒粒子。而ac76補(bǔ)回型重組病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中的增殖能力與野生型病毒無(wú)異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR證明，ac76的缺失不影響病毒DNA的復(fù)制。通過(guò)對(duì)重組病毒感染細(xì)胞的超薄切片進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在ac76缺失型重組病毒感染的細(xì)胞中，外形正常的核衣殼能在病毒發(fā)生基質(zhì)中大量裝配，并能在環(huán)帶區(qū)域成簇排列，但看不到病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的核內(nèi)膜泡結(jié)構(gòu)，核衣殼不能被囊膜包被形成包埋型病毒，只能形成沒(méi)有包埋病毒粒子

4、的多角體。和野生型病毒一樣，ac76補(bǔ)回型重組病毒感染的細(xì)胞中能形成正常的包埋型病毒和多角體。蛋白在細(xì)胞中定位通常與其功能密切相關(guān)。為了研究Ac76蛋白在感染細(xì)胞中的定位，我們構(gòu)建了ac76啟動(dòng)子控制下表達(dá)Ac76GFP融合蛋白的重組病毒，重組病毒感染的St9細(xì)胞中綠色熒光的分布表明，Ac76蛋白主要定位在感染細(xì)胞的環(huán)帶結(jié)構(gòu)區(qū)域，暗示該基因可能參與包埋型病毒的形成。關(guān)鍵詞：桿狀病毒，苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒，ac76，基因敲除，囊膜蛋白