桿狀病毒泛素基因的進(jìn)化與BmNPV泛素基因的特性研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）為雙鏈DNA病毒，其基因組共含有143個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF），是家蠶的主要病原體。BmNPV泛素基因（ubiquitin）編碼一個(gè)由77個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白。桿狀病毒是目前已知的僅有的含有泛素基因的病毒，而在真核生物中，泛素是一個(gè)廣泛存在且十分重要的小分子蛋白，在細(xì)胞凋亡、蛋白的特異性降解、細(xì)胞分化

2、等眾多方面都有著十分重要的作用。目前對(duì)于桿狀病毒泛素基因的研究尤其是BmNPV的泛素基因(vub)的研究還較少，本研究從生物信息學(xué)，轉(zhuǎn)錄時(shí)相，表達(dá)時(shí)相，基因的敲除、拯救與替換，49種桿狀病毒與16種昆蟲宿主泛素基因的差異與進(jìn)化等方面對(duì)BmNPV泛素做了基礎(chǔ)性的研究，為桿狀病毒泛素基因的后續(xù)研究提供了研究基礎(chǔ)，具體研究結(jié)果如下:
　　(1)生物信息學(xué)分析顯示，BmNPV泛素蛋白(VUB)由77個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)分子量約為8.65

3、kDa，等電點(diǎn)為6.56。該蛋白并無(wú)信號(hào)肽區(qū)域，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明該蛋白在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核當(dāng)中均有分布。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示VUB為一個(gè)球狀結(jié)構(gòu)，包含了3個(gè)α-螺旋和5個(gè)β-折疊，該結(jié)構(gòu)與所預(yù)測(cè)的家蠶泛素蛋白三維結(jié)構(gòu)十分相似。
　　(2)通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)vub進(jìn)行分子克隆并進(jìn)行原核表達(dá)，大量誘導(dǎo)VUB的表達(dá)，并對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化切割，成功制備多克隆抗體。驗(yàn)證所制備抗體的特異性與效價(jià)較高，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。
　　(

4、3)轉(zhuǎn)錄時(shí)相與表達(dá)時(shí)相分析均表明vub為極晚期基因，但是該基因在BmN細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時(shí)間比在家蠶中腸組織中的轉(zhuǎn)錄時(shí)間提前了約24小時(shí)。此外，表達(dá)時(shí)相分析表明，vub可能參與了家蠶細(xì)胞中的UPP途徑。三種不同品系家蠶(NB、306、BC8)中腸組織中vub的表達(dá)出現(xiàn)了比較明顯的差異，這暗示vub可能與家蠶抗病毒機(jī)制有一定的關(guān)系，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　(4)構(gòu)建重組Bacmid并轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過(guò)熒光報(bào)告蛋白EGFP觀察病毒的

5、轉(zhuǎn)染增殖情況，并通過(guò)TCID50分析來(lái)確定vub的缺失是否像AcMNPV泛素基因缺失一樣，導(dǎo)致BV的產(chǎn)量有大幅度下降。結(jié)果顯示，不論何種重組Bacmid，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后所觀察到的熒光現(xiàn)象基本一致，并未出現(xiàn)明顯差異，說(shuō)明vub的缺失并不會(huì)影響病毒基因組的復(fù)制。
　　(5)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，泛素基因在昆蟲宿主和桿狀病毒中都受到了很強(qiáng)的純化選擇壓力，且昆蟲宿主泛素基因所受到的純化選擇壓力要比桿狀病毒泛素基因更大，即昆蟲泛素進(jìn)化更為保守。系統(tǒng)