重組AAV(rAAV)桿狀病毒生產系統(tǒng)的研究.pdf

1、腺相關病毒(Adeno-associated Viruses,AAV)感染人體后不會產生致病性,通過去除病毒基因僅保留兩端ITR序列進一步增加了重組AAV載體的安全性,而且其攜帶的基因表達期比較長,因此在基因治療領域越來越受到人們的關注。然而,傳統(tǒng)的生產方式很難滿足臨床上對AAV載體高產量的需求,這成為AAV載體在臨床應用上的一個重大瓶頸,探索一種高效、安全和可放大的生產方式以得到高產量的AAV載體是滿足其臨床需求的必要條件。
　

2、　 除了腺病毒和單純皰疹病毒外,桿狀病毒也能為AAV的復制包裝提供輔助功能,而且桿狀病毒不會像腺病毒和單純皰疹病毒一樣對人體產生毒性,因此,利用桿狀病毒攜帶AAV包裝所需的順式和反式作用元件,借助桿狀病毒對昆蟲細胞Sf9的感染性,在昆蟲細胞中生產重組AAV載體,是一種較為理想且能滿足臨床需求的新型重組AAV生產方式。
　　 重組AAV的桿狀病毒生產系統(tǒng)需要兩類反式因子:一是AAV的復制蛋白Rep78和Rep52,另外一類是AA

3、V的衣殼蛋白Cap1,Cap2和Cap3,可以由兩個桿狀病毒分別攜帶或者由單一的桿狀病毒攜帶。該系統(tǒng)所需的另外一個順式組分是攜帶AAV2的ITR及外源表達框(如EGFP)的重組桿狀病毒。
　　 根據AAV2的Rep和Cap基因序列設計引物,PCR擴增Rep78、Rep52、Cap1及Cap2+3。Rep78和Cap2+3一組,Rep52和Cap1一組分別構建到pFastBacDual載體中。另外,我們借助一個能在昆蟲細胞中起作用

4、的內含子將Rep和Cap基因構建到一個同一載體中,借助內含子的作用,Rep表達框能同時表達Rep78和Rep52,而Cap表達框能同時表達Cap1和Cap2+3。將這幾個載體分別轉化DHl0BacTM感受態(tài)通過轉座重組得到重組Bacmid,轉染昆蟲細胞得到重組桿狀病毒Bac-AAV2Rep78Cap2+3、Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2RepiCapi。采用類似的方法得到重組桿狀病毒Bac-AAV2EGFP。其中,

5、Bac-AAV2Rep78Cap2+3,Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9細胞構成三桿狀病毒生產系統(tǒng),Bac-AAV2RepiCapi和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9細胞構成兩桿狀病毒生產系統(tǒng),兩套系統(tǒng)分別用來生產帶EGFP的重組AAV2載體rAAV2-EGFP。
　　 經初步研究證明,三桿狀病毒系統(tǒng)和二桿狀病毒系統(tǒng)都能成功包裝出rAAV2-EGFP病毒。生產出的病毒經AAV純化試劑盒

6、純化,通過定量PCR檢測病毒載體基因組產量,結果顯示:三桿狀病毒生產能力為每個Sf9細胞4.85x103VG(Virus vector genomes,病毒載體基因組),而二桿狀病毒達到了每個Sf9細胞6.12×104VG。進一步轉導HEK293細胞后經流式細胞儀檢測:前者生產能力為每個Sf9細胞3TU(Transduction Unit,轉導單位),后者則達到30TU左右,且感染HEK293細胞后都能看到較強的綠色熒光表達,說明病毒活