桿狀病毒介導(dǎo)的噬菌體Lambda-Red樣重組及其應(yīng)用.pdf

1、λ-噬菌體Red重組是由λRed操縱子三個(gè)基因（Redα、β、γ）編碼的蛋白酶所介導(dǎo)的同源重組，通常這種重組發(fā)生在大腸桿菌細(xì)胞中線性DNA與環(huán)狀DNA分子之間。外切核酸酶α消化DNA片段的5’端產(chǎn)生突出的3’端單鏈，該單鏈結(jié)合Redβ后可單鏈間互補(bǔ)退火（線-線重組），或者侵入雙鏈中同源區(qū)退火（線-環(huán)重組），最后由細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制完成重組，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除或替換。
　　桿狀病毒的堿性核酸酶AN和單鏈DNA結(jié)合蛋白LEF-3分別

2、是噬菌體λRedα外切酶和β重組酶（或者原噬菌體RecE/T）的同源物，具有各自相應(yīng)的蛋白酶活性。我們根據(jù)前期的研究推測(cè)桿狀病毒可能利用AN和LEF-3介導(dǎo)Red重組。為此我們構(gòu)建了一個(gè)可線性化的復(fù)制缺陷型病毒載體BmBacmid-KO1629-CAT-（BmBAC-KO1629-CAT-），通過線性化該載體與具有0-50 bp同源臂的GFP PCR產(chǎn)物共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，產(chǎn)生重組病毒，表明桿狀病毒的確能介導(dǎo)線-線Red樣重組。
　

3、　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒的線-線Red樣重組涉及到非同源的末端連接。我們通過線性化的BmBAC-KO1629-CAT--RFP與含有相同50bp右同源臂不同左臂的GFP PCR產(chǎn)物共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，產(chǎn)生一系列重組病毒證實(shí)桿狀病毒線-線Red樣重組存在非同源的末端連接。
　　基于桿狀病毒Red樣重組的特性，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種重組桿狀病毒無縫克隆的方法，利用重疊PCR合成含有必需同源臂的目的基因片段，然后直接與線性化的BmBAC-KO1