桿狀病毒介導的噬菌體Lambda-Red樣重組及其應用.pdf

1、λ-噬菌體Red重組是由λRed操縱子三個基因（Redα、β、γ）編碼的蛋白酶所介導的同源重組，通常這種重組發(fā)生在大腸桿菌細胞中線性DNA與環(huán)狀DNA分子之間。外切核酸酶α消化DNA片段的5’端產生突出的3’端單鏈，該單鏈結合Redβ后可單鏈間互補退火（線-線重組），或者侵入雙鏈中同源區(qū)退火（線-環(huán)重組），最后由細胞內的DNA修復機制完成重組，從而實現(xiàn)基因敲除或替換。
　　桿狀病毒的堿性核酸酶AN和單鏈DNA結合蛋白LEF-3分別

2、是噬菌體λRedα外切酶和β重組酶（或者原噬菌體RecE/T）的同源物，具有各自相應的蛋白酶活性。我們根據前期的研究推測桿狀病毒可能利用AN和LEF-3介導Red重組。為此我們構建了一個可線性化的復制缺陷型病毒載體BmBacmid-KO1629-CAT-（BmBAC-KO1629-CAT-），通過線性化該載體與具有0-50 bp同源臂的GFP PCR產物共轉染BmN細胞，產生重組病毒，表明桿狀病毒的確能介導線-線Red樣重組。
　

3、　進一步研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒的線-線Red樣重組涉及到非同源的末端連接。我們通過線性化的BmBAC-KO1629-CAT--RFP與含有相同50bp右同源臂不同左臂的GFP PCR產物共轉染BmN細胞，產生一系列重組病毒證實桿狀病毒線-線Red樣重組存在非同源的末端連接。
　　基于桿狀病毒Red樣重組的特性，我們設計了一種重組桿狀病毒無縫克隆的方法，利用重疊PCR合成含有必需同源臂的目的基因片段，然后直接與線性化的BmBAC-KO1