HA-VP2重組桿狀病毒的構(gòu)建及其表達(dá).pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)是引起雞和火雞的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病的病原。VP2是宿主的主要保護(hù)性抗原,它與IBDV的毒力強(qiáng)弱、抗原變異及病毒中和性抗體的誘導(dǎo)和識(shí)別有關(guān)。利用各種表達(dá)載體表達(dá)VP2用于制備基因工程疫苗是目前傳染性法氏囊病預(yù)防與控制研究的主要方向。桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Baeulovirus Expression Vector System,BEV

2、S)是一個(gè)以桿狀病毒為外源基因載體,以昆蟲(chóng)細(xì)胞為受體的表達(dá)系統(tǒng),它具有安全、高效、容量大、重組病毒易于篩選、表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行折疊和修飾且具有生物活性等特點(diǎn)。表位附加標(biāo)記(epitope tag),就是將附加的抗原表位融合到目的蛋白以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá),同時(shí)還可以通過(guò)親和層析法來(lái)純化目的蛋白及利用免疫熒光技術(shù)對(duì)標(biāo)記蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。HA-TAG是目前使用比較廣泛的表位附加標(biāo)記。本課題將HA-TAG與IBDV-VP2利用Bac—to-Bac

3、桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在CHO細(xì)胞系中進(jìn)行融合蛋白表達(dá),比較分析不同重組載體對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響,擇優(yōu)表達(dá)體系,為禽類基因工程疫苗的研制提供新的思路。
　　 以GenBank上已發(fā)表的IBDV-VP2序列為參考序列,應(yīng)用DNAstar軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,將HA-TAG基因序列融合于IBDV-VP2基因的5’端,通過(guò)PCR方法,擴(kuò)增HA-VP2基因,并將其克隆到pMD18-T載體上,經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析以及核苷酸序列測(cè)定,證明獲得

4、了含有HA-VP2融合基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pTZF-HA-VP2。再將HA-VP2基因亞克隆至先前構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC中,經(jīng)不同的酶組合后酶切鑒定,證明了獲得含有不同表達(dá)盒及調(diào)控元件的重組轉(zhuǎn)移載體pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I—HA-VP2、pTZF-LM-HA—VP2、pTZF-LM—I—HA-VP2、pTZF—SD-HA-VP2、pT

5、ZF—SD—I—HA-VP2、pTZF—WKC-HA-VP2、pTZF—LMC-HA-VP2、pTZF-SDC-HA-VP2,將這些轉(zhuǎn)移載體分別轉(zhuǎn)化至E.coliDH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,通過(guò)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生成重組穿梭質(zhì)粒rBac-TZF-WK—HA—VP2、rBac-TZF-WK-I-HA—VP2、rBac—TZF-SD—HA-VP2、rBac-TZF-SD—I-HA-VP2、rBac-TZF-LM-HA-VP

6、2、rBac-TZF-LM-I-HA-VP2、rBac-TZF-WKC-HA-VP2、rBac-TZF-SDC-HA-VP2、rBac-TZF-LMC-HA-VP2,轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后,獲得重組桿狀病毒P1代儲(chǔ)備,繼續(xù)擴(kuò)增病毒至P3代,空斑法分析病毒的滴度均在1-2×108pfu／mL左右。最后,將獲得的9個(gè)重組桿狀病毒同時(shí)侵染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO),利用SDS-PAGE和Western-blotting成功檢測(cè)到HA-VP2蛋白