PCR產物快速構建重組桿狀病毒的方法及相關功能蛋白的研究.pdf

1、昆蟲桿狀病毒載體表達系統(tǒng)是應用最為廣泛的真核表達系統(tǒng)之一。對于BmNPV病毒載體系統(tǒng)來說，傳統(tǒng)的同源重組構建重組病毒的方法存在重組效率低、技術復雜且耗時費力的問題，即使通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構建重組病毒也需要約2周左右的時間。本研究擬構建一種快速構建重組病毒的方法，無需多步克隆和篩選，操作簡單方便、周期短。
　　本研究是在己構建的復制缺陷型BmNPV穿梭載體RD-BmBacmid基礎上進行研究的。首先，合成與RD-BmBac

2、mid有50bp同源的DNA片段:左重組臂RA-L、右重組臂RA-R，然后與目的基因通過重疊PCR得到含有50bp同源臂的PCR產物。該PCR產物與線性化的RD-BmBacmid共轉染BmN細胞或家蠶幼蟲，一步產生重組病毒，無需篩選。
　　本研究中目的基因是AcGFP和DsRed兩種熒光蛋白報告基因。重疊PCR擴增出含有50bp同源臂的PCR產物（AcGFP-DHA和DsRed-DHA），再與線性化的RD-BmBacmid共轉染B

3、mN細胞，可以觀察到細胞病變和熒光，表明重組病毒表達了相應的目的蛋白。同時該方法也適用于家蠶幼蟲，可以觀察到轉染后的蠶體因表達相應熒光蛋白而變綠或變紅。
　　在進一步探究PCR產物快速構建重組桿狀病毒機制中，發(fā)現(xiàn)桿狀病毒LEF-3和AN分別是Red同源重組中的Beta和Exo蛋白的同源物，故克隆并表達純化LEF-3和AN蛋白以及體外實驗驗證其功能。
　　本研究成功建立了一種快速構建重組桿狀病毒的方法，操作簡單，省時省力，且能