Spodoptera屬Su(var)3-9的鑒定及在桿狀病毒感染過程中的作用和持續(xù)增強(qiáng)型重組桿狀病毒的構(gòu)建.pdf

1、第一部分 Spodoptera屬Su(var)3-9的鑒定及在桿狀病毒感染過程中的作用
　　核小體核心組蛋白N-端的各種翻譯后修飾，包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化及糖基化等，會(huì)影響組蛋白、DNA及多種細(xì)胞因子之間的親和力而改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)和基因的表達(dá)。由于這些修飾作用往往會(huì)有類似于DNA遺傳密碼的功效，在生物體的發(fā)育和基因的選擇性表達(dá)與調(diào)控等多個(gè)方面起著至關(guān)重要的作用，故常被稱為“組蛋白密碼”。位點(diǎn)和狀態(tài)專一的組蛋白賴氨酸或精

2、氨酸甲基化修飾主要是由一類含有SET結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)——組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)催化完成的。在眾多的HMTs中，SUV39家族的Su(var)3-9特異性地負(fù)責(zé)催化組蛋白H3第九位賴氨酸(H3K9)的三甲基化，其催化反應(yīng)產(chǎn)物H3K9mer3可以招募異染色質(zhì)蛋白1(Heterochromatin protein1，HP1)，共同作用，導(dǎo)致異染色質(zhì)化和基因沉默。同時(shí)，Su(var)3-9還能通過其N-端二聚化區(qū)與HP1的Chromo-Sh

3、adow結(jié)構(gòu)域發(fā)生直接的相互作用。此外，通過HP1以及MeCP2(methyl-CpG-binding protein2)等蛋白的橋梁作用，Su(var)3-9還能間接地與其他表觀遺傳修飾因子如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)等發(fā)生關(guān)聯(lián)，進(jìn)而參與到龐雜的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之中。
　　病毒侵染宿主的過程經(jīng)常會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞的正常活動(dòng)產(chǎn)生多方面的影響，同時(shí)也會(huì)激發(fā)宿主細(xì)胞抵抗病毒侵染的自我防御。表觀遺傳因子時(shí)常會(huì)參

4、與到這些過程中。目前已經(jīng)知道多種DNA病毒在侵入宿主細(xì)胞核后病毒基因組會(huì)形成類似于染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而受多種表觀遺傳修飾因子的調(diào)控。另一方面，病毒也會(huì)利用宿主細(xì)胞的表觀遺傳機(jī)制來保證自身的正常復(fù)制。桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)在侵染草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系Sf9時(shí)，也會(huì)致使宿主細(xì)胞的多方面正常生物學(xué)行為發(fā)生紊亂，如造

5、成細(xì)胞骨架的改變，細(xì)胞周期停滯于G2/M期，全局性的mRNA水平的下調(diào)和蛋白表達(dá)的關(guān)閉等等。同時(shí)也有報(bào)道證實(shí)了AcMNPV感染宿主細(xì)胞后病毒基因組中存在類似于核小體的結(jié)構(gòu)，并且多種表觀遺傳修飾因子抑制劑都會(huì)引起病毒基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的改變。但是在AcMNPV與宿主的相互作用過程中是否受組蛋白甲基化狀態(tài)的影響，以及這種影響是通過何種方式進(jìn)行的，至今尚無報(bào)道。
　　本研究在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda），甜菜夜蛾

6、（Spodoptera exigua）及斜紋夜蛾（Spodoptera litura）三種Spodoptera屬的昆蟲中克隆和鑒定了組蛋白H3K9的三甲基轉(zhuǎn)移酶基因Su(var)3-9及其轉(zhuǎn)錄剪接變體eIF2γ基因。在對(duì)Spodoptera Su(var)3-9的生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列在進(jìn)化中高度保守，并且具有種屬特異性。在體外分別表達(dá)了Su(var)3-9及eIF2γ蛋白并制備了多克隆抗血清，對(duì)其在天然情況下細(xì)胞中的表

7、達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)確認(rèn)，應(yīng)用免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明Spodoptera Su(var)3-9定位于細(xì)胞核。GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Spodoptera Su(var)3-9與底物H3的結(jié)合，同時(shí)也分別與本研究中鑒定出的兩個(gè)亞型的異染色質(zhì)蛋白1(HP1a、HP1b)結(jié)合。體外酶活實(shí)驗(yàn)表明SpodopteraSu(var)3-9具有催化H3K9三甲基化的活性并受Su(var)3-9特異性抑制劑Chaetocin的抑制，且該催化活性具有劑

8、量依賴性，在27℃下的酶活性要明顯高于37℃。體內(nèi)酶活分析同樣證實(shí)了Spodoptera Su(var)3-9催化組蛋白甲基化的能力以及后續(xù)產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞染色質(zhì)緊實(shí)度和基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在AcMNPV感染的Sf9細(xì)胞中，雖然絕大多數(shù)宿主細(xì)胞基因表達(dá)明顯下降，Su(var)3-9轉(zhuǎn)錄水平卻呈上升趨勢(shì)，伴隨宿主染色質(zhì)變得更為緊實(shí)。添加抑制劑Chaetocin或過表達(dá)Su(var)3-9會(huì)分別激活或抑制AcMNPV基因

9、組的復(fù)制和病毒極早期到極晚期的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄。
　　綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Su(var)3-9在桿狀病毒AcMNPV感染Sf9細(xì)胞時(shí)宿主基因表達(dá)的關(guān)閉過程中具有一定的作用，并且可能參與了細(xì)胞對(duì)入侵病毒的抵抗反應(yīng)。這些結(jié)果為深入了解病毒與細(xì)胞的相互作用機(jī)制，和更好地開發(fā)利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)提供了新的視野和思路。
　　第二部分牛乳頭瘤病毒1型復(fù)制元件顯著增強(qiáng)重組桿狀病毒介導(dǎo)的外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)

10、
　　桿狀病毒AcMNPV作為一種新型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)和基因治療載體在近年來受到了研究者的越來越多的關(guān)注。與現(xiàn)有的其他病毒載體相比，它的優(yōu)勢(shì)主要在于:AcMNPV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不會(huì)復(fù)制，自身基因也不會(huì)表達(dá)，無細(xì)胞毒性;簡單的操作即可獲得高滴度的重組病毒;外源基因的容量大等等。然而，桿狀病毒介導(dǎo)的外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)為瞬時(shí)表達(dá)，且表達(dá)水平往往不夠高，使得桿狀病毒載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用受到一定的限制。尋求增強(qiáng)持續(xù)

11、表達(dá)的策略是目前亟待解決的問題。
　　牛乳頭瘤病毒1型（Bovine papillomavirus type1，BPV-1）是一種小型的DNA病毒，BPV-1基因組以多拷貝游離于染色體外的方式(episome)持續(xù)存在于被感染宿主的細(xì)胞中。病毒的上游調(diào)控序列（upstream regulatory region，URR）和早期蛋白E1，E2對(duì)病毒基因組復(fù)制的發(fā)動(dòng)和維持是必需的，其他復(fù)制相關(guān)因子則全部由宿主提供。此外，在有E2蛋白存

12、在的情況下，URR還具有增強(qiáng)子的活性，可以對(duì)提高鄰近的異源啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　在本研究中，我們將BPV-1的這些元件引入桿狀病毒基因組中，并在多個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中比較了重組桿狀病毒及對(duì)照組病毒介導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)水平，同時(shí)還檢測(cè)了重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照病毒相比，在HEK293、HeLa、BHK-21、CNE、CHO-K1及MDCK細(xì)胞中，攜帶BPV-1 URR和E1，E2元件的重組桿

13、狀病毒介導(dǎo)的報(bào)告基因EGFP(enhanced green fluorescence protein)的表達(dá)水平均有了非常顯著的提高，表達(dá)時(shí)間也有所延長。此外，帶有BPV-1復(fù)制元件的新型的重組桿狀病毒載體對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性。
　　因此，BPV-1復(fù)制元件URR和E1，E2的存在能夠明顯改善桿狀病毒介導(dǎo)的外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，并且不影響桿狀病毒載體固有的生物安全性。這一結(jié)果有助于推進(jìn)桿狀病毒作為一種更為有效