家蠶HN1L蛋白在桿狀病毒侵染過(guò)程中調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目模式昆蟲(chóng)，桿狀病毒是專一性侵染鱗翅目昆蟲(chóng)的病毒，家蠶與桿狀病毒之間相互作用的研究具有多方面的應(yīng)用價(jià)值，二者之間相互作用機(jī)制的闡明對(duì)害蟲(chóng)的生物控制、外源蛋白的真核表達(dá)以及宿主對(duì)病毒免疫抗性機(jī)制的揭示等方面都具有十分重要的意義。
　　血液-神經(jīng)表達(dá)蛋白1樣蛋白(hematalogical and neurological expressed1protein-like，hn1l)廣泛表達(dá)于多種動(dòng)物組織中，該蛋白被抑制表達(dá)

2、后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象，是一種重要的功能蛋白，但其在家蠶細(xì)胞中的生物學(xué)功能尚未可知。前期的桿狀病毒感染前后的家蠶細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)差異組學(xué)分析結(jié)果顯示，家蠶HN1L蛋白在病毒侵染的家蠶細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下調(diào)。為了深入了解該蛋白的生物學(xué)功能，主要研究了以下內(nèi)容:①通過(guò)對(duì)HN1L蛋白序列（基因序列號(hào)）進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)家蠶HN1L與人類和小鼠同源性達(dá)到59％，并具有相同的保守結(jié)構(gòu)域。因此，推測(cè)家蠶HN1L蛋白可能也具有相似的生物學(xué)功能;

3、②構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET32a-hn1l并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)、純化后，免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體，用于后續(xù)研究;③構(gòu)建了重組瞬時(shí)表達(dá)載體pIEX-1-hn1l用于在家蠶細(xì)胞中過(guò)表達(dá)目的蛋白，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞36h后hn1l開(kāi)始表達(dá)水平，48h后達(dá)到峰值，之后趨于穩(wěn)定，由此確定了最佳表達(dá)時(shí)間為48h;④細(xì)胞活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HN1L蛋白過(guò)表達(dá)可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力(p＜0.01)，促進(jìn)細(xì)胞增殖;

4、⑤DNA片段化檢測(cè)結(jié)果表明，HN1L蛋白表達(dá)上調(diào)對(duì)DNA片段化水平有一定程度的抑制作用(p＜0.05)。此外，Western bolt檢測(cè)結(jié)果也顯示，與正常細(xì)胞相比，HN1L蛋白的過(guò)表達(dá)對(duì)于病毒感染誘導(dǎo)的caspase-9酶原活化和Bax表達(dá)水平上調(diào)均顯著下降，而B(niǎo)cl-2的表達(dá)水平增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，過(guò)表達(dá)HN1L可顯著抑制BmNPV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，推測(cè)HN1L對(duì)細(xì)胞凋亡也具有一定的抑制作用;⑥檢測(cè)HN1L

5、蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示HN1L過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中周期蛋白Cyclin D較正常細(xì)胞減少，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果也表明G1期細(xì)胞減少而S期細(xì)胞增加(p＜0.05)，說(shuō)明家蠶HN1L蛋白對(duì)細(xì)胞的G1/S期轉(zhuǎn)換有一定的促進(jìn)作用;⑦通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了病毒在過(guò)表達(dá)HN1L蛋白的BmN細(xì)胞中的復(fù)制能力，結(jié)果顯示病毒的復(fù)制能力顯著低于正常BmN細(xì)胞(p＜0.05)，說(shuō)明HN1L蛋白對(duì)桿狀病毒的復(fù)制具有一