桿狀病毒糖蛋白GP41的研究.pdf

1、O-連接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是糖蛋白常見的翻譯后修飾，它存在于所有多細(xì)胞生物體中，O-GlcNAc的調(diào)控出錯(cuò)與眾多的疾病相關(guān)聯(lián)，如癌癥、二型糖尿病和老年性癡呆。對(duì)桿狀病毒基因組全序列的分析發(fā)現(xiàn)桿狀病毒具有30個(gè)共有的保守基因，它們組成了桿狀病毒的核心基因，gp41糖蛋白基因便是30個(gè)核心基因之一。本論文選擇斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus

2、，SpltMNPV)gp41基因及其編碼的GP41糖蛋白作為研究對(duì)象，對(duì)其轉(zhuǎn)錄特征、翻譯后的加工修飾、亞細(xì)胞定位與病毒結(jié)構(gòu)定位、修飾的糖苷類型等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究；并綜合利用Bac-to-Bac和ET重組的策略，構(gòu)建了缺失苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(AutographacaiifornicamultinucleocapsidmultinucleocapsidNPV，AcMNPV)gp41基因的重組病毒，研究GP41蛋白對(duì)病毒侵染的影響。

3、 序列分析表明，SpltMNPVgp41基因位于基因組ORF76，編碼330個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為36.894kDa，在gp41基因起始密碼子ATG的上游存在一個(gè)保守的桿狀病毒晚期基因啟動(dòng)子元件——ATAAG，在終止密碼子TGA的下游沒有發(fā)現(xiàn)典型的polyA加尾信號(hào)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)GP41含有一個(gè)潛在的O-連接糖基化位點(diǎn)和四個(gè)潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)。氨基酸親水性分析表明，GP41蛋白可能是膜蛋白，但GP41不是整合膜蛋白。

4、 氨基酸同源性比較分析發(fā)現(xiàn)，SpltMNPVGP41與中國棉鈴蟲核多角體病毒(Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HaSNPV)和美國棉鈴蟲核多角體病毒(Helicoverpazeasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HzSNPV)的同源性最高，為66％；與顆粒體病毒(Granulovirus，GV)同源性相對(duì)

5、較低，為32～36％；與CuniNPV(Culexnigripalpusnucleocapsidnucleopolyhedrovirus)同源性最低，只有6％。氨基酸序列排比及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，SpltMNPVGP41存在與其他桿狀病毒所共有的結(jié)構(gòu)特征，10個(gè)α-螺旋和2個(gè)β-折疊以及其他的保守區(qū)。在所有已知NPVs的GP41中(CuniNPV除外)，其N-端約有50-60個(gè)氨基酸殘基組成一個(gè)保守的藍(lán)色銅蛋白Cupredoxin結(jié)

6、構(gòu)域。 在離體條件下，RT-PCR分析表明，SpltMNPVgp41基因的轉(zhuǎn)錄從病毒感染后12h就能檢測到，并且持續(xù)到感染后96h；5'RACE結(jié)果表明，SpltMNPVgp41基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在ATG上游晚期啟動(dòng)子ATAAG中的堿基T。Western印跡結(jié)果表明，SpltMNPVgp41基因編碼的蛋白在宿主細(xì)胞中晚期表達(dá)。綜合這些結(jié)果，可以確定SpltMNPVgp41基因是晚期表達(dá)基因。 通過PCR方法擴(kuò)增得到Splt

7、MNPVgp41全長基因，將其克隆到5'端有6×His編碼序列的原核表達(dá)載體pQE30上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15[PREP4]，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了一個(gè)分子量為37.9kDa融合蛋白。以純化過的6×His-GP41融合蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔，得到該蛋白的抗血清。免疫印跡分析表明，該抗血清能與感染斜紋夜蛾核多角體病毒的細(xì)胞蛋白樣品發(fā)生特異性反應(yīng)。在SpltMNPV感染的細(xì)胞中GP41蛋白的大小為41kDa，較融合蛋白大3kDa，推測該

8、蛋白發(fā)生了翻譯后修飾。衣霉素抑制試驗(yàn)和N-糖苷酶PNGaseF試驗(yàn)證實(shí)了GP41蛋白沒有被N-糖基化。然而采用生物素標(biāo)記的凝集素印跡試驗(yàn)，有3種識(shí)別O-GlcNAc糖苷的凝集素(ECL、LEL和BSL)與SpltMNPVGP41蛋白結(jié)合，證實(shí)了SpltMNPVGP41是O-連接的GlcNAc糖蛋白。 Western印跡和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在病毒感染的早期，SpltMNPVGP41蛋白分布在感染細(xì)胞的細(xì)胞核中；晚期則分布在

9、整個(gè)細(xì)胞中。病毒結(jié)構(gòu)中的定位分析顯示，SpltMNPVGP41是包埋型病毒粒子(occlusion-derivedvirus，ODV)特有的結(jié)構(gòu)蛋白；存在于ODV的囊膜(E)中。 本論文還綜合利用Bac-to-Bac和ET重組的策略，通過基因敲除等方法研究了AcMNPVGP41蛋白在桿狀病毒感染周期中的生物學(xué)功能。 首先，人工合成一對(duì)長76bp的引物，其中50bp與AcMNPVgp41基因跨膜結(jié)構(gòu)域(TD)側(cè)翼序列同源，

10、另26bp分別為帶自身啟動(dòng)子的氯霉素抗性基因(Cm)的兩端序列，通過PCR方法擴(kuò)增獲得同源重組線性DNA片段，用限制性內(nèi)切酶DpnI消化模板以分離純化線性DNA片段。將此線性DNA同源片段電激轉(zhuǎn)化入含AcMNPVBacmid的大腸桿菌E.coli中，誘導(dǎo)同源重組，篩選gp41基因缺失而插入Cm基因的重組BacmidAcgp41KO。為了更直接的觀察gp41基因可能對(duì)病毒侵染產(chǎn)生的影響，將可在熒光顯微鏡下觀察的gfp基因和可在相差顯微鏡下

11、觀察的多角體基因作為雙標(biāo)記基因，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座作用插入Acgp41KO，構(gòu)建缺失型重組病毒AcKO-GP。置于早期啟動(dòng)子ie-1下表達(dá)的GFP熒光蛋白用以指示重組病毒芽殖型病毒粒子(buddedvirus，BV)在離體細(xì)胞中的傳播，多角體蛋白則用來指示重組病毒在離體細(xì)胞中感染的進(jìn)程。為了確證AcKO-GP在其增值感染中表型的改變確實(shí)是由gp41基因的缺失所導(dǎo)致，將受其自身啟動(dòng)子控制下的gp41基因同樣通過轉(zhuǎn)座作用補(bǔ)回

12、Acgp41KO，獲得補(bǔ)回型重組病毒AcGP-R。野生型AcMNPVBacmid通過轉(zhuǎn)座作用獲得雙標(biāo)記的重組病毒AcWT-GP。將三種重組病毒DNA分別轉(zhuǎn)染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)昆蟲細(xì)胞(Sf-9)，由GFP的傳播狀態(tài)可直接觀察這三種重組病毒的侵染能力的區(qū)別。Westernblot分析顯示，AcMNPVgp41基因TD區(qū)的缺失，使AcMNPVgp41基因無法表達(dá)AcMNPVGP41蛋白，AcMNPVgp41

13、基因TD區(qū)的缺失能夠用以研究AcMNPVgp41基因?qū)Σ《厩秩镜挠绊?；補(bǔ)回型重組病毒AcGP-R使補(bǔ)回的AcMNPVgp41基因表達(dá)出AcMNPVGP41蛋白，補(bǔ)回型重組病毒AcGP-R可以作為研究AcMNPVgp41基因?qū)Σ《厩秩居绊懙淖糇C。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，AcGP-R和AcWT-GP均能產(chǎn)生BV和ODV，且兩種的BV生長曲線也基本一致；與此相反，AcKO-GP在轉(zhuǎn)染的晚期能夠產(chǎn)生ODV，然而不能產(chǎn)生BV粒子，而使病毒無法擴(kuò)散，而